毛磊
（南京中医药大学，江苏南京 210023）
时至今日，越来越多的植物药作为抗癌药在临床上得到广泛应用。大多数具有抗癌活性的药物来源于植物中提取的天然化合物或合成衍生物，且结构上与木质素配体、紫杉烷二甲苯二苯甲酸酯、生物碱等相关[1]。大量研究表明，从可食用植物或中草药中提取的天然化合物在体外或体内模型中均展现出良好的抗癌活性，且可使多种异常信号通路恢复正常[2-4]。这些天然化合物大多数通过控制癌细胞生长以及炎症和凋亡的关键信号分子来发挥作用。目前，人们对特定分子和细胞靶点作用的小分子药物的鉴定和开发非常感兴趣，因为确定药物疗效需要其具有明确地作用机制。
通常，遗传分子改变是导致癌细胞异常生长的原因，选择某些致癌特定靶点进行治疗可能是最有针对性的策略。但是，由于大多数癌细胞都会发生多种类型的基因突变，因此单靶点的药物其抗癌活性通常较低，甚至可能导致癌细胞出现耐药性。因此，目前普遍认为组合疗法是很好的治疗方法。粗糠柴毒素（Rottlerin）是一个多靶点天然化合物，这一特性使该药物可能成为一个非常具有前景的抗癌药物，本篇综述将重点介绍其在非经典通路上的抗癌活性。
东南亚等热带地区广泛分布着粗糠柴，Rottlerin是粗糠柴的主要成分，是一种覆盖在其果实表面的红色粉末，相对分子质量约为516 g/mol。自古以来，粗糠柴在民间被用于治疗感染或炎症性疾病，例如疥疮、支气管炎、腹部疾病等[5]。粗糠柴粉末也可以用于体内驱虫（如绦虫、蛔虫等），可能是由于其具有引起腹泻的作用[6]。后来，有研究认为是由于Rottlerin激活钾离子通道，使细胞膜发生超极化，从而使寄生虫死亡并从宿主肠道中排出[7-8]。商品化的Rottlerin为橙棕色粉末，溶于二甲基亚砜、氯仿或乙醇，不溶于水。
Rottlerin 的商业生产始于1994 年，GSCHWENDT等报道蛋白激酶C-δ（Protein Kinase C-δ，PKCδ）被3 ～6 μmol/L 的Rottlerin 选择性抑制，在相同浓度下比对其他PKC 的抑制作用强5 ～30 倍[9]。从此，许多关于PKCδ 信号传导的研究使用Rottlerin 作为特异性抑制剂，然而这个理论目前仍然存在着一些争议，如有证据表明Rottlerin 在体外对PKCδ 激酶活性没有直接影响[10]。此外，大量研究表明Rottlerin 抑制许多其他蛋白激酶，如p38 调节/活化的蛋白激酶（PRAK）、MAP 激酶活化蛋白激酶-2（MAPKAP-2）、AKT8 病毒癌基因细胞同系物/蛋白激酶B（Akt/PKB）和钙/钙调蛋白依赖性激酶（CaMK）[11]。此外，SOLTOFF 证明Rottlerin 将线粒体呼吸与氧化磷酸化解偶联，从而降低腺苷三磷酸（ATP）水平并影响多种细胞功能[12]。因此，Rottlerin 是PKCδ 的特异性抑制剂的观念在整个科学界受到挑战和改变，关于Rottlerin 的机制研究目前还并不十分清晰，需要更多地进行研究和探索。
最近，许多研究揭示了Rottlerin 的其他一些性质，例如氧化淬灭[13]、抗增殖[14]、抗血管生成[15]、抗炎[16]、抗过敏[17]、抗菌[18]、抗真菌[19]和抗寄生虫[20]。就癌症而言，一些研究报告了Rottlerin 通过多种作用机制对不同肿瘤细胞的功效。如今，Rottlerin 已可以被认为是一种多靶点药物，能够干扰凋亡和自噬途径，从而可以通过单独或联合治疗的方式发挥抗癌作用[21]。在本综述中，将重点探讨Rottlerin 对乳腺癌细胞和黑色素瘤细胞的抑制能力，以期能够为该药物将来的临床应用提供理论基础。
乳腺癌细胞系MCF-7 是最广泛使用的乳腺癌体外模型之一，是研究抗癌药物的基本模型[22]。由于促凋亡蛋白半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的缺失和抗凋亡蛋白B 淋巴细胞瘤-2（B-Cell Lymphoma-2，BCL-2）的高表达，MCF-7 细胞具有极高的凋亡阈值。此外，MFC-7 细胞表达低水平的自噬关键调控蛋白苄氯素1（Beclin1，BECN1），因此也对经典通路触发的细胞自噬具有抗性。但TORRICELLI 等发现，在非饥饿和不加任何处理的条件下，Rottlerin 不仅抑制增殖，而且以时间和剂量依赖性地杀死MCF-7 细胞[23]。这项研究提供的证据表明，MCF-7 细胞中Rottlerin 触发的细胞凋亡机制是由Caspase-3 决定的。因此，Rottlerin 可能对不同的癌细胞类型具有细胞毒性，要么诱导细胞凋亡抵抗的细胞发生自噬，要么刺激具有细胞凋亡功能的细胞发生凋亡。此外，研究发现Rottlerin 通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶标复合物1（mTORC1）导致MCF-7 细胞发生自噬[23]。然而，这一事件的发生并未依赖于经典通路的磷酸化，同时也不发生于哺乳动物雷帕霉素靶标（mTOR）已知上游信号分子的招募——例如AMP 活化蛋白激酶（AMP-Activated Protein Kinase，AMPK）信号通路。该研究利用亲和蛋白实验，发现Rottlerin 通过与mTOR 蛋白形成复合物来抑制其活性，即Rottlerin 调控信号分子的新机制可能是通过与蛋白直接相互作用抑制关键酶的活性。
除MCF-7 细胞外，在其他背景和化学敏感性不同的癌细胞中也评估了Rottlerin 的细胞毒性作用。在这方面，值得一提的是对SK-MEL-28 黑色素瘤细胞的研究。众所周知，SK-MEL-28 细胞具有许多遗传信息突变，这使它们对大多数化学治疗药具有明显的耐受性。大量证据表明，SK-MEL-28 细胞中除了存在原癌基因B-RAF 突变之外，还存在着抑癌基因p53 和PTEN 的突变，这是由基因组扩增引起的凋亡相关基因p21 下调及细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）的过表达产生的[24-26]。DAVERI 等的研究证明Rottlerin 作为一种抑制药物的功效，从机制上讲，Rottlerin 抑制核因子κB（Nuclear Factor kappa-B，NF-κB），从而下调Cyclin D1 的表达，进而抑制了SK-MEL-28 细胞的增殖[27]。有趣的是，这项研究发现Rottlerin 没有诱导SK-MEL-28 黑色素瘤细胞中Caspase-3 和Caspase-9 的激活或多聚ADP 核糖聚合酶1（Poly ADP-Ribose Polymerase，PARP）的裂解。因此，Rottlerin 诱导细胞死亡的过程并不是细胞凋亡的过程。
尽管Rottlerin 诱导细胞发生自噬的能力较高，但SK-MEL-28 黑色素瘤细胞并未因自噬而死亡，因为自噬抑制剂氯喹未能阻止Rottlerin 诱导细胞发生的死亡。从机制上讲，Rottlerin 并未刺激Beclin-1 引起的黑色素瘤细胞的自噬，而是通过激活AMPK 信号通路及其下游底物乙酰辅酶A 羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC），从而使靶点Raptor（mTORC1 的一个亚单位）发生磷酸化[28]。这一全新的机制很容易使人联想到Rottlerin 处理细胞后是否会发生坏死性凋亡。然而实际情况更加复杂，因为SK-MEL-28 黑色素瘤中的Rottlerin 细胞毒性并不是由坏死性凋亡介导的。坏死性凋亡是一种不寻常的程序性细胞死亡形式，依赖于关键的上游激酶-受体相互作用蛋白激酶1（Receptor Interaction Protein Kinase 1，RIP1）和RIP3 对死亡受体的刺激。研究发现，使用RIP1 激酶抑制剂Nec-1 未能挽救Rottlerin 诱导的细胞死亡，表明坏死性凋亡途径未参与其中[28]。
为了尝试解开Rottlerin 诱导细胞死亡的机制，综合上述内容所提到的，不难发现在Rottlerin 处理细胞后，绝大多数的磷酸化或非磷酸化的蛋白，如AMPK、Raptor、乙酰辅酶A 羧化酶（ACC）、真核生物起始因子4E 结合蛋白1（4EBP-1）、Beclin-1、mTOR、PKCδ、Caspase-3 和Caspase-9，都出现了下调。这一情况表明，Rottlerin 处理后细胞的蛋白质翻译过程受到了极大的破坏，而且极大可能是由于mTORC1 的抑制产生的。有研究表明，Rottlerin 通过阻断真核生物起始因子4E（eIF4E）抑制了4EBP-1 的磷酸化，进而限制了蛋白翻译的启动[29]。这些结果表明，靶向eIF4E 作为新的抗癌药物途径或将成为一种新兴的治疗方式。
除了上述机制外，Rottlerin 还可以通过抑制内质网应激（Endoplasmic Reticulum stress，ER stress）负调节起始因子eIF2 来阻止蛋白质翻译过程[20]。对于这一机制，已有文献报道了Rottlerin 在人类结肠癌细胞中诱导ER stress 的能力[30]。在对一组人类恶性肿瘤细胞进行的类似研究中，证实Rottlerin 通过ER stress/Chop（C/EBP 同源蛋白，C/EBP-homologous protein）介导的死亡受体5（Death Receptor 5，DR5）上调和Caspase-8 介导的细胞死亡触发了细胞凋亡旁通路[31]。因此，Rottlerin 触发的ER stress 可以直接导致翻译过程减少或通过旁通路引起凋亡或两者同时发生，这可能取决于不同的细胞类型。
基于本篇综述总结的证据，很明显Rottlerin 在多个不同的维度（增殖、经典和非经典途径引起的凋亡、自噬、蛋白质合成）和细胞模型上具有抑制肿瘤进展的能力，使这种化合物成为可能用于开发新型治疗方法的药物。尽管处于非常早期的研究阶段，仍然缺乏严格的临床前和临床研究，但从药理学的角度来看，在体内和体外模型中，Rottlerin 在细胞和组织中都能得到有效吸收，甚至在肿瘤组织（胰腺癌的异种移植模型）和Rottlerin 饲喂小鼠的血浆中检测到大量药物[32]。当前，研究者多会将Rottlerin 与姜黄素进行类比，然而两者有很大不同。姜黄素是一种源自香料姜黄的多酚，是研究最多的天然药物之一[33]。尽管Rottlerin 和姜黄素在执行其药物作用（如抗肿瘤、抗氧化、抗淀粉样蛋白、抗炎、抗菌等）时调控相同信号分子和通路，但姜黄素本身的生物利用度差且在全身分布较低，其在体内被快速代谢、在肝脏中结合并从粪便中排出[34]。
在临床应用中，抗癌药物的功效往往由于其对正常细胞的不利影响而被限制使用。令人兴奋的是，无论是体内或体外模型，Rottlerin 在非致瘤细胞中的毒性几乎不存在，这在之前的一些研究中已被充分证实[35-36]，甚至在正常皮肤成纤维细胞中也得到了同样的结果[29]。
有趣的是，一些Rottlerin 的无毒作用甚至可以用于治疗非肿瘤性疾病。例如，对皮肤中角质形成细胞和内皮细胞的细胞抑制作用以及对NF-κB 的抑制已被提出作为银屑病的治疗方法[37-38]。此外，Rottlerin打开钾离子通道并充当氧化猝灭剂的能力可以改善冷性心脏停搏后心脏的功能恢复[13,39]。
显然，细胞培养和动物模型的数据需要与相应的临床试验相结合，以评估并确认Rottlerin 的抗癌特性以及其他治疗潜力，同时深入地了解其作用机制，为Rottlerin 的临床应用提供坚实的理论基础。
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