张 坤，王凯乐，张鹏九，刘中芳，杨 静，樊建斌，赵劲宇，范仁俊，高 越
（山西农业大学植物保护学院/山西省农业科学院植物保护研究所/农业有害生物综合治理山西省重点实验室，太原 030031）
近年来，苹果种植产业遇到诸多虫害问题，严重影响了果实的数量和品质。苹果全爪螨Panonychusulmi(Koch)别名苹果红蜘蛛，属真螨目叶螨科，是世界性果树害螨[1]。主要分布于中国的山西、河南、辽宁、山东等省，其体长约0.45 mm，宽0.29 mm，体态呈圆红色，在中国北方果区年生6～9 代，产卵力较强，生长速度快，发育周期短，环境适应性强[2-4]，伴随着近年来果树耕作制度、栽培技术的转变以及过度使用化学杀虫剂对生态平衡的影响，苹果全爪螨已由次要害虫上升为主要害虫。针对苹果树螨害问题，目前的防治措施主要为化学防治，由于化学农药的频繁使用，导致了土壤化学农药的高残留、果树上耐药性害螨的出现等一系列生态环境问题，这些因素严重限制了化学农药的使用和苹果产业的发展。
植物精油作为一种植物源物质，可随水蒸气蒸馏出来而又与水不相混溶，是植物的次生代谢产物[5]。植物精油在自然界中分布广泛，化学成分繁多，主要有萜类化合物、酸性化合物（如苯甲酸）、醇类化合物（如香叶醇、薄荷醇）、醛类化合物（如柠檬醛、肉桂醛）、酮体以及酚类等，其中萜烯类、萜类和芳香酚类化合物在精油活性中起重要作用[6-9]。已有的文献研究证明了植物精油中具有一定的杀虫、杀螨活性物质，作用方式多样，包括触杀、熏蒸、驱避、拒食、抑制种群生长发育和繁殖等[10-12]，具有开发成为防治螨类害虫的植物源杀螨剂的潜力。截至目前，国内外已有多篇文献报道了如薄荷精油、陈皮精油、松树油、柠檬精油、桉叶油、青蒿精油、生姜精油等植物精油对各类虫害具有一定的防治作用[13-19]，作用于靶标生物时其作用机理各不相同，作用原理为影响虫害的生长发育和水分代谢，或者抑制其体内的代谢解毒酶、破坏其体壁结构，溶解角质层，增强化学物质的渗透性等[20]。但是，目前关于植物精油在果树螨害防治领域中的应用研究较少，为防治苹果全爪螨，本研究探索7 种植物精油对苹果全爪螨的生物活性，筛选出较高活性的薄荷精油，并通过GC-MS 分析了薄荷精油的化学成分，评价薄荷精油对苹果全爪螨的触杀、熏蒸、驱避活性，旨在为苹果全爪螨的绿色防治和天然杀螨剂的开发提供科学依据。
1.1 供试螨源
苹果全爪螨Panonychusulmi(Koch)为山西农业大学植物保护学院果蔬病害实验室室内用苹果苗和枝叶连续饲养的敏感品系，培养箱饲养条件：温度（25±1） ℃、相对湿度60%～80%、光周期16L∶6D。
1.2 供试植物
植物采集名录见表1。
表1 植物采集名录Table 1 Eight plants directory
1.3 试剂及仪器
仪器：连续蒸馏装置（上海五相仪器仪表有限公司），SHZ-DIII 循环水式真空泵（上海卧泉泵业有限公司），RE-52CS 型号旋转蒸发器（上海达洛科学仪器有限公司），FA1604B 万分之一电子分析天平（上海精密仪器仪表有限公司），KQ-300E 超声波振荡器（上海五相仪器仪表有限公司），ULUP-Ⅱ超滤除热源型超纯水器（西安优普仪器设备有限公司），Potter 喷雾塔（英国波特有限公司），安捷伦气质联用仪（深圳市三莉科技有限公司），HWS-80 恒温恒湿培养箱（上海森信实验仪器有限公司）。
试剂：正己烷、无水硫酸钠、琼脂、吐温-80（市售化学纯）、丙酮（市售分析纯）均购于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，聚四氟乙烯购于上海三爱富新材料股份有限公司。
1.4 精油提取
将供试的7种植物采集样品晒干后进行粉碎，每种样品用分析天平准确称取100 g样品分别放入到2500 mL水中浸泡24 h，然后控制蒸馏装置温度为100 ℃蒸馏6 h，所得油水混合物用正己烷萃取6 h，萃取产物经无水硫酸钠脱水12 h 后过滤，用旋转蒸发器减压蒸发浓缩（40 ℃）回收正己烷，残存的油状液即为精油，测比重后收集产品于棕色磨口精油瓶中，置于4 ℃冰箱中密封保存备用。精油提取率（%）＝提取的精油质量/原材料质量×100%。
1.5 精油活性测定
1.5.1 触杀活性测定 苹果全爪螨为刺吸式口器，采用Potter 喷雾法进行室内触杀活性测定。将供试精油用丙酮溶解后配制成母液，再用吐温-80 水溶液将母液稀释至0.391、0.781、1.563、3.125、6.250 g/L。将接有苹果全爪螨的苹果树叶片置于Potter 喷雾塔下喷雾处理（压力100 kPa，体积4 mL，沉降2 min）后密封倒扣，重复3 次，以只有丙酮和吐温-80 水溶液的处理为对照，然后置于26 ℃恒温培养箱培养，分别于12、24、48 h 后调查结果，记录苹果全爪螨的死亡头数并统计7 种精油喷雾触杀苹果全爪螨的毒力参数。以毛笔触动后无反应或不能正常爬行者视为死亡，计算LC50。死亡率（%）＝死亡虫数/总虫数×100；
校正死亡率（%）＝100×（处理组死亡率―对照组死亡率）/（1―对照组死亡率）。
1.5.2 熏蒸活性测定 采用培养皿密闭熏蒸法进行室内熏蒸活性测定。培养皿（9.0 cm×2.0 cm），剪取一条滤纸（长度3.0 cm×宽度1.0 cm），用双面胶将滤纸条两端固定在培养皿盖上（滤纸条与皿盖留有空隙）。分别在滤纸条上滴加3.18、6.36、12.72、25.44、50.88 μL 精油，并快速用封口膜密封，使得培养皿密闭空气中精油浓度为25、50、100、200、400 μL/L。其余步骤同1.5.1，计算其熏蒸毒力，计算LC50。
1.5.3 驱避活性测定 参照Zhang 等[21]采用的药膜法进行驱避活性测定。剪取直径为9 cm 的圆形滤纸片，对折后裁成两半备用。用移液枪吸取浓度为LC50（熏蒸处理24 h 后）的精油丙酮稀释液滴于其中一半滤纸片上，另一半为丙酮对照，滤纸片自然晾干1 min 后用双面胶粘贴于直径为9 cm 的琼脂培养皿底部（培养皿壁涂聚四氟乙烯防止苹果全爪螨逃脱）。把30 头苹果全爪螨用吸虫器接入培养皿中间位置，使其自行向处理区和对照区扩散，重复3 次。放置于26 ℃培养箱中，分别观察记录3、6、12、24 h 后处理与对照滤纸上的苹果全爪螨个数，计算驱避率。驱避率（%）＝（对照区虫数－处理区虫数）/对照区虫数×100。
驱避结果按照表2 的分级标准进行分级。
表2 驱避活性的分级标准Table 2 Classification criteria of repellent activity
1.5.4 精油成分分析 采用安捷伦气质联用仪检测精油化学成分。气相色谱条件：采用HP-5MS 色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），起始温度设置60 ℃，保持3 min，以10 ℃/min 升至280 ℃，保持5 min，进样温度280 ℃，载气为高纯氦气，氦气流速为2.0 mL/min，分流比50∶1，进样量1.0 μL。质谱条件为：EI 离子源，电子轰击能量70 eV，离子源温度230 ℃，扫描质量范围20～650 m/z，质谱采集延迟时间2 min。使用NIST 谱库图谱检索进行定性，定量方法为气相色谱面积归一法。
1.6 数据统计与分析
运用Microsoft Office Excel 2010 和Data Processing System（DPS 7.05）进行分析。采用Duncan’s 检验，在P＜0.05 显著水平下测定各处理间的显著性差异。
2.1 植物精油对苹果全爪螨的触杀毒力
测定7 种植物精油对苹果全爪螨的触杀毒力见表3。结果表明，处理12 h 后，薄荷精油对供试螨的LC50为2.13 g/L，95%置信区间为1.63～2.79 g/L；
陈皮精油对供试螨的LC50为4.79 g/L，95%置信区间为2.41～9.54 g/L；
松树油、柠檬精油、生姜精油、桉叶油、青蒿精油对供试螨的LC50均大于5 g/L，触杀毒力显著低于中国《国家农药产品微毒剂量标准》[22]的临界值5 g/L，因此可认为上述4 种精油在处理12 h 后对供试螨无触杀毒力。处理24 h 后，薄荷精油对供试螨的LC50为0.83 g/L，95%置信区间为0.81～0.86 g/L。最后，处理48 h 后，薄荷精油对供试螨的LC50为0.77 g/L，95%置信区间为0.71～0.84 g/L。综上，在密闭环境条件下薄荷精油对供试螨的喷雾触杀活性强于其他6 种植物精油，且触杀毒力随时间延长而增强。
表3 七种植物精油对苹果全爪螨的触杀毒力Table 3 Contact toxicity of seven plant essential oils to Panonychus ulmi
2.2 植物精油对苹果全爪螨的熏蒸毒力
测定7 种植物精油对苹果全爪螨的熏蒸毒力见表4。结果表明，处理12 h 后，薄荷精油对供试螨的LC50为382.86 μL/L，95%置信区间为326.16～449.47 μL/L；
处理24 h后，薄荷精油对供试螨的LC50为73.89 μL/L，95%置信区间为69.64～78.39 μL/L；
处理48 h 后，薄荷精油对供试螨的LC50为16.08 μL/L，95%置信区间为10.78～23.98 μL/L，说明精油对供试螨的熏蒸毒力随着时间的延长而明显增强。此外，在3 种不同的处理时间下，其他6 种精油对供试螨的熏蒸毒力均明显低于薄荷精油。综上，在密闭环境条件下薄荷精油对供试螨的熏蒸活性强于其他6 种植物精油。
表4 七种植物精油对苹果全爪螨的熏蒸毒力Table 4 Fumigation toxicity of seven plant essential oils to Panonychus ulmi
2.3 植物精油对苹果全爪螨的驱避活性和驱避等级
为了探究开放环境中精油气味对苹果全爪螨移动行为的影响，取熏蒸处理24 h 时各精油的LC50为精油驱避活性测试浓度，测定3、6、12、24 h 时苹果全爪螨的驱避活性。由表5 可见，7 种植物精油对供试螨的驱避活性均随时间的延长而增强，具有较强的时间依赖性。其中薄荷精油、陈皮精油在驱避处理24 h 后，驱避率超过70.00%。此结果说明在开放环境中，精油通过挥发产生的气味可以对苹果全爪螨产生驱避作用，使得精油处理区域的供试螨数量减少。当处理时间由3 h 延长到24 h 后，薄荷精油、陈皮精油、松树油、柠檬精油、生姜精油、桉叶油、青蒿精油对供试螨的驱避率分别增加了2.62、3.06、3.29、3.92、3.95、5.18、5.64 倍，且处理时间持续到24 h 后，薄荷精油的驱避等级可以达到Ⅳ级，驱避活性具有持效性。
表5 植物精油对苹果全爪螨的驱避效果Table 5 Repellent effects of essential oils on Panonychus ulmi
2.4 薄荷精油的化学成分分析
最后，采用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）分析了薄荷精油的化学成分。薄荷精油经过GC-MS 检测共鉴定出34 个峰，所检测出的化学成分占精油总含量的99.67%，由表6 可知，相对含量在0.3%以上的峰有31 个，其中出峰时间在10.757 min 时的物质含量最高，供试薄荷精油的主要成分为薄荷醇（32.16%）、D-柠檬烯（16.44%）、4-异丙基甲苯（11.32%）、3-蒈烯（10.27%）、丙二酸二乙酯（9.57%）、薄荷酮（3.91%）、主要成分总含量为83.67%。
表6 薄荷精油的化学成分分析Table 6 Chemical composition analysis of peppermint essential oil
与化学杀螨剂相比，植物源杀螨剂不仅对螨虫具有拒食、毒杀、麻醉、抑制生长发育及干扰正常行为等生物活性，而且还具有对环境友好、对非靶标生物安全、作用方式特异、促进作物生长并提高抗虫性等特点[23]。
植物精油不仅具有农用活性（杀虫、抑菌、除螨、除草等），同时也具有医疗、食品保鲜作用[24-26]。但薄荷精油作为新兴的杀螨产品，想要取代化学制品仍然面临很多问题，如薄荷精油的作用机理尚未完全清晰、提取技术的应用难以走进工业化车间、挥发性强等。同时，本实验室在前期研究中发现薄荷精油对苹果树常见病害中的苹果树腐烂病（主要致病菌黑腐皮壳属病菌）和斑点落叶病（主要致病菌链格孢苹果专化型菌）也具有抑菌作用[27]，可尝试将薄荷精油的抑菌和杀螨作用结合起来，进行苹果树专用的植物源抑菌-杀螨制剂研究。
本文采用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）分析了薄荷精油的化学成分，相对百分含量最高的是薄荷醇（32.16%），D-柠檬烯（16.44%）次之。而精油的毒性主要是醇、醛类化合物的存在[28]，也有可能是各种主要成分与其他次要活性成分发生某种类型的协同作用[29]。所以，薄荷精油能够对苹果全爪螨具有较强的生物活性可能与其中薄荷醇、柠檬烯含量较高且其他次要成分能够对主要成分起协同作用有关。结合文献分析，薄荷醇主要由薄荷叶片产生[30]，是植物所产生的高挥发性精油，因为薄荷醇具有较强的渗透作用，所以临床上常用于帮助主体药物更好地进入靶标被受体吸收[31-33]。而在农业中，薄荷醇与其他活性成分相结合后，表现出与薄荷醇单体不同的理化性质，能够降低薄荷精油整体的表面张力，增加了其展布能力，促进了害螨对薄荷精油的渗透、吸收，有利于破坏害螨的体壁结构，溶解其角质层[34]。本研究中由于薄荷醇的渗透作用，可能增强了薄荷精油对供试螨背部体表的渗透性，在触杀和熏蒸处理中帮助薄荷精油的其它有效成分透过虫体，与靶标高效结合，提高有效成分的透皮吸收量。此外，薄荷醇属于环类单萜的一种[35]，是典型的挥发性化合物，具有与甲基溴类似的熏蒸作用[36]，它们可以迅速渗透到昆虫体内阻碍或干扰其生理功能。除此之外，单萜类化合物还具有与除虫菊酯（pyrethrin）类似的触杀作用[37]。而柠檬烯作为一种小分子化合物被多篇文献报道具有一定的抑菌、杀虫作用，对一些细菌、线虫、螨虫均具有防治作用[38-40]，尤其对二斑叶螨和苹果全爪螨均具有极强的生物活性[41]。胡军华等[42]研究了柑橘提取物中主要杀螨活性成分，证明柠檬烯杀螨活性高于柠檬醛、松油醇、芳樟醇、β-蒎烯，且柠檬烯作为一种天然成分，能减少传统农药带来的弊端。关于柠檬烯的杀虫机理，有文献提到柠檬烯通过破坏昆虫体壁蜡质层，导致水分丧失，同时体壁破坏使体液排泄，堵塞气孔，干扰氧气交换，从而使昆虫窒息、失水死亡[43,44]。综上，本研究中薄荷醇的促透作用可能增强了柠檬烯及其它活性成分被苹果全爪螨吸收的速度和强度，使得高浓度的柠檬烯及其它活性成分进入苹果全爪螨体内展开作用。此外，薄荷精油的化学成分鉴定结果与之前文献报道基本相同，如杨二妹等[45]通过同样的方法测定了薄荷精油的化学成分，其主要成分为薄荷醇（21.17%）、柠檬烯（12.59%），与本文研究结果虽含量有差别，但主要成分一致，可能是由于原材料的产地及采集时间和提取部位不同所导致。由此可见，虽然薄荷精油的生物活性低于化学农药，但是薄荷精油中含有对苹果全爪螨有效的活性成分，且具有低毒、环保的特点，是一种具有开发价值的天然杀螨剂。但本文仅在实验室内测定了薄荷精油对苹果全爪螨的生物活性，考虑到苹果全爪螨在温室环境中接触到精油的含量及精油的作用方式及精油的光热稳定性可能与实验室操作环境存在差异，因此，下一步要进行相关温室试验，以便更精确客观地评价薄荷精油对苹果全爪螨的生物活性，从而为开发防治苹果全爪螨的绿色植物源杀螨剂提供科学依据。同时，研究薄荷精油的微胶囊或纳米乳液制备，有效防止精油挥发，降低光热因子对精油的影响。最后，将微胶囊或纳米乳液制备技术与其他高新技术（如超临界流体技术）相结合，开发出能满足市场不同需求的产品，大力拓展薄荷精油的应用领域。
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