唐书恒 ， 李 洋 ， 吕建伟
(1.中国地质大学(北京) 能源学院, 北京 100083；
2.安徽理工大学 地球与环境学院, 安徽 淮南 232001；
3.油气资源与工程全国重点实验室, 中国石油大学(北京), 北京 102249)
微生物是地球表生系统物质循环和环境演化最活跃、最强大的地质营力之一，推动着全球或区域的生物地球化学循环[8]。近年来，非常规天然气的商业开发和煤炭资源的清洁利用推动煤储层微生物的研究[9]。与煤生物降解和碳循环相关的微生物群落在全球煤储层中普遍存在。煤的复杂有机分子无法被单一微生物降解，煤储层涉及多种微生物的协同代谢作用，如可降解煤中有机组分细菌或真菌[10]。严格厌氧的产甲烷菌可利用中间产物产出甲烷，根据其代谢类型和可用底物的不同，常见乙酸营养型、氢营养型和甲基营养型，以及可代谢较复杂甲氧基芳香化合物的甲氧基营养型[11-13]。
煤储层等原位环境中微生物群落组成、分布、代谢活动及协同共生关系受地下原位环境条件影响[14-15]。氧对微生物的影响取决于微生物细胞中酶对氧气的耐受性，产甲烷菌对氧极为敏感，所以接近地表的富氧条件使其酶活性迅速下降甚至失活；
硫酸盐还原菌降解有机物为产甲烷菌提供可用底物，同时硫酸盐还原菌在硫酸盐浓度满足其代谢需求时与产甲烷菌竞争乙酸等底物占优势而抑制产甲烷菌代谢[16-17]。所以原位环境中的微生物群落多样性、代谢和共生关系对储层条件响应明显，产甲烷菌与硫酸盐还原菌的代谢差异可有效识别储层氧化还原环境及煤层气保存条件。
沁水盆地赋存着大量的煤炭和煤层气资源，其南部是中国最早进行煤层气商业开发的区域之一，包括郑庄、樊庄、潘庄、柿庄北和柿庄南等区块[18-19]。目前，柿庄南区块是沁水盆地南部重要煤层气开发区块，有近2 000 口煤层气地面井。该区块是自东南向西北延伸的单斜构造，从区块边缘东南氧化径流带逐渐过渡为西北深层滞流区，高产井多分布在该区西部[20]。以柿庄南区块山西组3 号煤层为目标层，基于以上储层生物地球化学特征与微生物多样性和生物地理分布可评价储层氧化还原环境从而判别储层煤层气保存条件。因此，笔者以16S rRNA 生物测序结合地球化学数据识别煤层气储层环境以评估煤层气存储条件与勘探开发潜力。
沁水盆地南部是中国煤层气资源重要勘探开发区，柿庄南区块位于沁水盆地南部西北倾斜坡带上，含煤地层包括本溪组、太原组、山西组和下石盒子组，其中本溪组和下石盒子组的薄煤层不具经济开采价值，太原组和山西组的15 号和3 号煤层较厚且稳定，是煤层气开采的主要层位。研究对象3 号煤埋深650～1 000 m，平均厚度为6 m[18,20]。如图1 所示，柿庄南区块东南地势较高的晋获断裂带部分出露地层可接受大气降水或地表水补给并向西径流，导致研究区东南部较西北部地下水径流活跃。由于研究区西部不导水寺头断裂对该区储层具有封堵作用，形成该区由东南向西北的径流-停滞的地下水条件。
图1 柿庄南区块3 号煤埋深及采样点分布Fig.1 Buried depth of No.3 coal and sampling points in the coal reservoir from the Shizhuangnan Block
2.1 样品采集
在柿庄南区块系统采集77 口3 号煤煤层气井排采水样，所选井位远离断层和陷落柱发育区。为了反映储层地球化学特征与产气量的关系，避免大气降水或地表水径流干扰，采样时间均避开雨季。用于地球化学测试和微生物测序的水样直接从煤层气排采井口采集，并分别装在5 L 容量瓶和50 mL 离心管中。为了减小误差和满足所需生物量，每个采样点采集5个离心管微生物样品。水样取自流量稳定的煤层气井以避免排水管道中残留水的影响。取样前，容器用水样冲洗3 次，所采水样充满容器以尽量减少其顶部空气。用于微生物测序的样品在预处理前保存在0 ℃左右保温箱中并在一周内完成生物测序工作。沁水盆地南部普遍采用2%氯化钾水力压裂，所选煤层气井在压裂后具有长期稳定的排水周期以排除压裂液影响。张松航等[5]以10 meq/L 的Cl-浓度作为压裂液污染点。研究所采水样Cl-浓度均小于10 meq/L，即压裂液影响可忽略不计。如图1 所示，采样井位分布在研究区中西部，包括高、中、低产量井。
2.2 实验方法
采样期间，利用便携式氧化还原电位仪现场测定ORP(Oxidation-Reduction Potential)。高且正的ORP表明氧化性强，低且负的ORP 表明还原性强。离子测试基于煤炭行业标准MT/T 894—2000《煤矿水水质分析》。用于地球化学测试的水样过滤后酸化(pH ＜ 2)进行阳离子分析。电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-AES)和离子色谱仪(IC)分别测定阳离子和阴离子浓度，测定精度为±2%。δ13CDIC等同位素利用稳定同位素质谱仪(ThermoFisher MAT 253)进行分析，测定精度为±0.01%。采用16S rRNA 测序技术对微生物基因序列进行分析。低温条件保存的微生物样品首先在实验室离心处理(5 000 r/min)以去除上层清液，用于微生物测序。使用FastDNA 试剂盒提取基因用于聚合酶链反应(PCR)。16SV4 扩增引物为515F(GTGCCAGCMGCCGCGGTAA)、806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)。PCR 扩增反应周期为：95 ℃，5 min，30 次循环；
95 ℃，30 s；
56 ℃，30 s；
72 ℃，1 min；
72 ℃，10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增PCR 质量，并在HiSeq 平台进行测序。根据系统发育或群体遗传学需要，对序列进行分类以了解测序结果中菌群数量。相似度大于97%被确定为OTU(Operational Taxonomic Unit)。为了获得每个特定OTU的物种分类信息，需要对OTU 代表序列进行分类分析，并在不同物种水平上对样本的群落组成进行计数。
3.1 储层地球化学特征与煤层气保存条件
在柿庄南区块77 口煤层气井采集水样，现场测定水样的ORP 和pH 绘制成图2。水样呈偏弱碱性，其pH 在7.2～8.8。不同井位所采水样ORP 变化范围在-127～184，即储层氧化还原环境存在一定差异。其中41 口井水样ORP 是负值，表示相对还原储层条件；
其余36 口井水样ORP 为正值，表示相对氧化储存环境。中高产井所采水样ORP 值普遍偏负，而低产井水样ORP 值普遍较大。
图2 柿庄南区块储层ORP、pH 与产气情况关系Fig.2 Plot of ORP and pH versus coalbed methane production in the coal reservoir from the Shizhuangnan Block
图3 柿庄南区块储层Na+、HCO-3 与产气情况关系Fig.3 Plot of Na+ and HCO-3 concentrations versus coalbed methane production in the coal reservoir from the Shizhuangnan Block
图4 柿庄南区块储层SO24- 、 δ34S(SO24- )与产气情况关系Fig.4 Plot of SO24- concentrations and δ34S(SO24- ) versus coalbed methane production in the coal reservoir from the Shizhuangnan Block
3.2 储层碳硫同位素对煤层气储层环境的指示意义
溶解无机碳(DIC)是水溶液中无机碳成分的总和，包括二氧化碳、碳酸、碳酸氢盐和碳酸盐。溶解无机碳同位素(δ13CDIC)揭示了无机碳来源及其影响过程。在研究区储层水环境中，溶解无机碳主要来源于大气降水或地表水以及碳酸盐溶解，其同位素δ13CDIC普遍偏负[30-31]。而煤储层的δ13CDIC可能受碳循环相关微生物代谢作用影响。当储层中硫酸盐浓度较高时，硫酸盐还原菌在与产甲烷菌竞争底物时占优而抑制产甲烷菌的代谢活动，当硫酸盐逐渐耗尽产甲烷菌活性才逐渐增强。产甲烷菌是严格厌氧微生物，在还原环境利用偏轻的无机碳使残余δ13CDIC偏正[32-34]。如图5 所示，负的δ13CDIC多见于SO42-质量浓度偏高区域，偏正的δ13CDIC集中在SO42-质量浓度偏低区域，中高产井也相应集中在SO42-质量浓度偏低且δ13CDIC偏正的还原储存环境[35-37]。但该区域也存在部分低产井，可能是储层含气量不足所致，也可能因为储存渗透率差无法形成压降漏斗，但这些井具备增产潜力。
图5 柿庄南区块储层SO24 -、δ13CDIC 与产气情况关系Fig.5 Plot of SO24 - concentrations and δ13CDIC versus coalbed methane production in the coal reservoir from the Shizhuangnan Block
3.3 储层微生物丰度、多样性与协同共生关系
如图6 所示，取已测得硫酸盐同位素的10 个样品(图4)做16S rRNA 生物测序，在门的水平上，微生物 主 要 由Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria、 Spirochaetes、 Euryarchaeota 和Chloroflexi 组成。与大多数煤储层研究一致，Proteobacteria 是最丰富的微生物类型，包括Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria 和Deltaproteobacteria，它们参与煤等复杂有机物质的生物降解和发酵过程。Firmicutes 可使芳烃脱甲基，Bacteroidetes 含可对纤维素、蛋白质和多糖等有效降解的微生物类型，Actinobacteria 是煤储层常见的水解脂质物质的丝状细菌，Spirochaetes 可在厌氧条件降解复杂有机质。大多数产甲烷菌属于Euryarchaeota[38-39]。
图6 柿庄南区块储层16S rRNA 基因测序微生物相对丰度Fig.6 Relative abundances of microorganisms within phyla identified by 16S rRNA gene sequencing in the coal reservoir from the Shizhuangnan Block
研究区包含Methanobacteriales、Methanomicrobiales 和Methanosarcinales 等产甲烷菌类型。硫酸盐还原菌以Desulfovibrionales 和Desulfuromonadales 为代表。储层原位生物地球化学环境因素影响微生物代谢和协同共生关系。在研究区，硫酸盐还原菌(Desulfovibrionales 和Desulfuromonadales)和产甲烷菌(Methanobacteriales、Methanomicrobiales 和Methanosarcinale)在相对较低硫酸盐环境中共存。但硫酸盐水平可能在一定程度上影响硫酸盐还原菌和产甲烷菌之间的共生关系。硫酸盐还原菌在有机质降解过程发挥作用为产甲烷菌提供底物，也会在硫酸盐充足条件下与产甲烷菌竞争乙酸且占优，而产甲烷菌只有在相对还原且硫酸盐耗尽的环境才逐渐活跃而进行代谢活动[40]。在研究区，硫酸盐还原菌在高质量浓度硫酸盐的区域丰度略高(图4、6)。因此，硫酸盐还原菌和产甲烷菌在煤储层环境存在竞争和协同共生关系。
原位储层环境是微生物群落能量获取和物质交换的场所，直接影响微生物群落的丰度、多样性和代谢功能[17,30]。煤储层等地下空间存在自然生物降解复杂有机物的微生物群落，微生物通过合作、共生或竞争共享资源以维持其生存和繁殖[41-42]。柿庄南区块东南部接受地表水或大气降水，由东南向西北的径流使研究区形成氧化还原环境的区域分布。研究区未发现ANME(Anaerobic Methanototropicarchaea)，有机物等生物氧化可与硫酸盐还原等微生物代谢过程结合。硫酸盐还原菌能分解乙醇和乳酸为产甲烷菌提供可用底物，同时硫酸盐还原菌与产甲烷菌具有相似可用底物，对产甲烷菌代谢起到一定抑制作用[17-18]。硫酸盐还原菌(Desulfovibrionales 和Desulfuromonadales)和产甲烷菌(Methanobacteriales、Methanomicrobiales 和Methanosarcinale)在研究区煤储层共存。δ13CDIC和δ34随硫酸盐消耗逐渐增大以及生物地理分布证实产甲烷菌受硫酸盐还原菌抑制，随硫酸盐等可用电子受体耗尽后产甲烷菌等厌氧微生物才开始活跃，即还原条件提高产甲烷菌代谢活性。以以及产甲烷菌、硫酸盐还原菌等微生物丰度和代谢表征微生物代谢的储层环境并对煤层气的保存条件予以评估。
(1)柿庄南区块为西倾单斜构造，3 号煤埋深自东向西逐渐增大。研究区东南晋获断裂带接受大气降水或地表水补给，并沿储层向西北径流。西侧不导水寺头断层对储层具有封堵作用，形成东南相对氧化和西北相对还原的储层环境条件。水岩作用、阳离子交换和微生物代谢等造成地球化学区域分布特征。高产井水样通常含有高质量浓度Na+( ＞ 250 mg/L)、HCO3-( ＞ 500 mg/L)和负的ORP，即滞留或还原的储层环境是煤层气保存的有利区。
(3)储层存在丰富的微生物群落类型，它们在有机物分解、甲烷生成和硫酸盐还原等过程发挥重要作用。研究区产甲烷菌以Methanobacteriales、Methanomicrobiales 和Methanosarcinales 为主，硫酸盐还原菌以Desulfovibrionales 和Desulfuromonadales 为代表。微生物对储层地球化学环境较敏感，产甲烷菌和硫酸盐还原菌间存在协同与竞争关系，且其相对丰度和分布差异受硫酸盐水平影响。
以上研究将储层生物地球化学用于煤层气勘探开发有利区优选。区块尺度上的生物地理分布及其代谢表达决定了区域生物地球化学循环。今后需耦合水动力场、微生物场、地球化学场等探究储层成藏的条件和潜力，寻找切实可行的储层改造方案，助力以煤层气生物工程实现煤层气规模效益开发。
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