张 峰 王春成 王 冰 薛士鹏
南阳医学高等专科学校1教务处,2中医系,3针灸骨伤系,4基础医学部,河南南阳 473000
骨质疏松症(osteoporosis,OP)系以骨组织微结构破坏、骨量减少、骨强度降低、骨脆性增加、容易发生骨折等为特征的代谢性骨病,可分为原发性和继发性两大类。原发性OP系年龄增加或妇女绝经后骨组织发生的生理性退变,包含绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP),其指妇女在绝经后因卵巢功能衰退,雌激素水平降低,导致骨吸收大于骨形成而出现骨量降低、骨微结构破坏的全身骨代谢障碍性疾病[1]。骨量在30岁时达到高峰,此后开始发生骨丢失,妇女绝经后骨丢失率迅速上升,容易出现OP。OP造成腰背部疼痛、驼背、骨折等严重后果,其中骨折以胸腰椎、髋骨、腕骨骨折多见,对患者的健康和生活质量造成严重影响[2]。目前,OP的药物治疗主要分为增加骨形成药物和抑制骨吸收药物两大类,包括甲状旁腺激素、雌激素类、降钙素、选择性雌激素受体调节剂、活性维生素D与双磷酸盐等[3];长期服用这些药物会产生毒副作用,并且容易发生耐药;因此寻找更加安全可靠的治疗方式是亟待解决的问题。
原发性OP属于中医“骨痿”范畴,肾虚是其发病的根本原因[4]。中医学认为,肾为先天之本,肾藏精、主骨生髓,骨髓化生有源而骨壮,肾气不足则骨无以充,骨矿含量降低而发为OP;同时脾为后天之本、气血生化之源,若年老体弱,脾胃运化功能减退,无法给骨骼提供充分的滋养,则逐步发展为OP。补骨脂具有温肾助阳、健脾止泻的功效,它含有多种活性成分,如香豆类的补骨脂素、异补骨脂素及异补骨脂查尔酮等[5]。现代药理学研究证明补骨脂的有效成分具有激素样作用,可以避免雌激素治疗OP容易诱发恶性肿瘤的副作用,但补骨脂提取物治疗PMOP的具体作用机制尚不明确[6]。本研究拟通过建立去卵巢骨质疏松大鼠模型,探讨补骨脂提取物对模型大鼠骨代谢水平的影响及可能机制,以期为PMOP临床治疗提供科学证据。
1.1 实验动物
清洁级雌性SD大鼠60只,体质量30～40 g,购自河南省实验动物中心,动物许可证号为SCXK(豫)2005-0005。将大鼠分笼饲养,每笼5只,室温饲养,自由进食和饮水,笼内自由活动。
1.2 实验药品
补骨脂素:纯度≥98%,规格100 mg/片,由四川省维克奇生物科技有限公司提供,货号为wkq-00101。阿仑膦酸钠片:由北京福元医药有限公司提供,批号:22204009,规格:70 mg/片。
1.3 主要试剂及仪器
骨钙素(osteocalcin,OCN)、骨特异性碱性磷酸酶(bone-specific alkaline phosphatase,BAP)、Ⅰ型胶原交联C-末端肽(C-terminal telopeptide of type Ⅰ collagen,CTX)的酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(上海雅吉生物科技有限公司,批号:20170602、20170704、20170629)。Wnt3a、β-catenin多克隆抗体(无锡英纽瑞生物医药科技有限公司,批号:20170409、20170418)。双能X线骨密度监测仪(美国GE公司,型号Prodigy Pro),全自动酶联免疫吸附分析仪(瑞士Tecan公司,型号Freedom EVO 75),核酸蛋白测定仪(德国Eppendorf公司,型号BioPhotometer D30),荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司,型号iQ5)。
1.4 造模及干预方法
将60只大鼠随机分为对照组、模型组、补骨脂提取物组、西药组,每组各15只。在麻醉、消毒、铺巾后,除对照组外,其余各组于大鼠腹白线处作长度为2 cm的纵切口,切除两侧卵巢组织进行造模;对照组大鼠仅暴露卵巢而不行切除术。造模成功后,补骨脂提取物组给予补骨脂素(88 mg/kg)灌胃,西药组给予阿仑膦酸钠(7 mg/kg)灌胃,对照组和模型组则灌胃等量的生理盐水,连续12周。
1.5 观察指标与检测方法
采用ELISA法检测各组治疗后大鼠血清骨代谢指标水平,包括OCN、BAP、CTX,操作步骤严格按照产品说明书进行。
采用RT-PCR法检测股骨和胫骨骨髓中Wnt3a和β-catenin的mRNA表达。RT-PCR是将RNA的反转录和cDNA的PCR相结合的技术,首先经反转录酶的作用,从RNA合成cDNA,再以cDNA为模板,在DNA聚合酶作用下扩增合成目的片段。具体操作方法如下:抽取大鼠右侧股骨和胫骨骨髓保存于-80℃,采用Trizol法提取其总RNA,测定其浓度和纯度后,以总mRNA为模板,应用反转录试剂盒,反转录合成cDNA,并以cDNA为模板,加入目的基因引物序列Wnt3a(上游5＇-GGTGCTAACACAGCAGCTTAAT-3＇,下游5＇-GGAAGCGATGGCATGGACAA-3＇)、β-catenin(上游5＇-TGGACAATGGCTACTCAAGCTGAC-3＇,下游5＇-GGGATGAGCGGCATCAAACTGCGT-3＇)进行PCR扩增。反应条件:93℃变性35 s,50℃复性35 s,72℃延伸1 min,变性到延伸总共35个循环。用1%琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR扩增产物,使用Gene Tools凝胶成像系统照相并保存。采用Image J软件进行半定量分析,Wnt3a和β-catenin的mRNA相对表达量是以Wnt3a和β-catenin相应条带的A值除以GAPDH相应条带的A值得到的结果。
采用双能X线骨密度监测仪监测大鼠第4腰椎和双侧股骨骨密度(bone mineral density,BMD)值。
1.6 统计学分析
2.1 各组血清骨代谢标志物OCN、BAP和CTX水平比较
与对照组比较,模型组大鼠血清CTX水平显著升高(P<0.05),OCN、BAP含量明显降低(P均<0.05);与模型组比较,各用药组大鼠血清CTX水平显著降低(P均<0.05),OCN、BAP含量明显升高(P均<0.05),但各用药组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
表1 各组大鼠OCN、BAP和CTX水平比较
2.2 各组骨髓中Wnt3a和β-catenin的mRNA水平比较
与对照组比较,模型组大鼠骨髓中Wnt3a和β-catenin的mRNA表达明显降低(P均<0.05);与模型组比较,各用药组大鼠Wnt3a和β-catenin的mRNA表达水平均升高(P均<0.05),但各用药组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。
表2 各组大鼠骨髓中Wnt3a和β-catenin的mRNA表达水平比较
2.3 各组第4腰椎及左、右股骨BMD比较
与对照组比较,模型组大鼠第4腰椎及左、右股骨BMD显著降低(P均<0.05);与模型组比较,各用药组大鼠第4腰椎及左、右股骨BMD均升高(P均<0.05),但各用药组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。
表3 各组大鼠第4腰椎及左、右股骨BMD比较
OP系与年龄、性别、环境、遗传等因素密切相关的退行性疾病,其中PMOP多见于中老年女性。女性绝经期后,体内雌激素分泌减少,骨量快速减少,导致骨密度降低,骨脆性增加,进而产生腰背部、髋部及四肢疼痛的症状,且脊柱椎体前部松质骨压缩变形,脊椎前屈,形成驼背。中医认为,OP属于“骨痿”“腰痛”“骨痹”“骨枯”等范畴,主要病机为肾脏亏虚,补肾壮骨为其治疗大法。
骨的重建和修复维持骨的动态平衡。随着年龄增长,骨的微细损伤日积月累,骨重建与骨修复失去代偿和平衡。OCN、BAP、CTX是常用的血清骨代谢标志物。其中血清CTX是骨吸收标志物,其升高常提示破骨细胞活跃,骨吸收增加[7]。OCN、BAP与骨形成关系密切,两者的增高通常预示着成骨细胞生成和分化活跃。本实验结果显示,与对照组相比,模型组大鼠血清CTX水平升高,骨形成标志物OCN、BAP水平降低,骨丢失明显。而阿仑膦酸钠、补骨脂提取物干预12周后,给药组大鼠CTX水平降低,骨形成标志物OCN、BAP水平升高,表明补骨脂提取物可促进骨形成、降低骨吸收,有利于缓解骨质疏松症状。此外,与模型组相比,给药组大鼠股骨和腰椎椎体BMD明显升高,表明补骨脂提取物可以改善模型大鼠的骨密度。
Wnt/β-catenin信号通路作为骨形成和愈合的重要调节途径,在骨骼发育和骨平衡中占据重要地位。Wnt/β-catenin信号通路不仅与骨形成、骨密度增加及骨硬化密切相关,而且直接影响破骨细胞的功能[8]。Wnt信号通路是成骨细胞生成、分化和增殖过程中的关键信号通路;β-catenin是启动Wnt信号通路的关键靶点蛋白,而Axin2则是抑制Wnt信号通路的主要蛋白[9]。当Wnt、β-catenin表达增强时,成骨细胞活跃,骨形成占优势。本研究结果发现,补骨脂提取物干预12周后,大鼠骨髓中Wnt、β-catenin的mRNA表达升高,提示补骨脂提取物可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路,促进成骨细胞生成、分化和增殖,增加骨形成。
综上,补骨脂提取物对去卵巢大鼠骨质疏松有改善作用,能减少骨丢失、增加骨形成,从而治疗骨质疏松症;其机制可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关,具体作用机制还需要进一步研究证实。
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