刘金林,陈 明
(1.安庆医药高等专科学校,安徽 安庆 246052;2.安徽中医药大学)
阿维巴坦(Avibactam)属于二氮杂双环辛酮化合物,其药理机制为:β-内酰胺酶丝氨酸亲核作用于阿维巴坦酰胺键,两者形成共价结合物,即酶-抑制剂复合体,性质稳定难以水解,但可再经环合作用又形成阿维巴坦药物原型。此过程,一是亲核破坏阿维巴坦酰胺键的速率远远大于环合恢复的能力,可以长时间维持酶-抑制剂复合体;二是阿维巴坦自身结构可通过环合作用恢复,亲核可与其重复发生开环反应形成复合体,最终使β-内酰胺酶处于长期抑制状态,进而丧失水解β-内酰胺环的能力。阿维巴坦本身无明显的抗菌活性,但与各类头孢和碳青霉烯抗生素联合使用时,能显著抑制A型和C型的β-内酰胺酶,尤其是能明显增强对含有超广谱β-内酰胺酶以及AmpC酶的大肠杆菌和克雷伯肺炎杆菌的抗菌活性。目前,阿维巴坦被视为前景较好的非β-内酰胺类抑制剂[1]。
阿维巴坦临床上用其钠盐,阿维巴坦钠的合成[2-3]是以(2S,5R)-5-[(苄氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯为起始物料,经过3步化学反应加1步成钠盐制备目标化合物阿维巴坦钠。见图1。
图1 阿维巴坦钠合成工艺路线
起始物料是决定原料药质量的重要组成部分,完善起始物料选择准则和严格控制起始物料的选择及质量要求,有助于规范原料药的生产和提高原料药的质量。本研究采用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)[4-5]进行测定,通过验证确认了方法的可行性,为阿维巴坦起始物料(2S,5R)-5-[(苄氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯的含量测定提供了依据,适用于阿维巴坦起始物料(2S,5R)-5-[(苄氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯含量测定。
1.1对照品及样品 (2S,5R)-5-[(苄氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯(上海必奕医药科技有限公司,批号:200813);(2S,5R)-5-[(苄氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯对照品(QCC,批号:03-MAR-21-52);杂质1(珠海优润医药科技有限公司,批号:20181103);杂质2(珠海优润医药科技有限公司,批号:20181209);杂质3(珠海优润医药科技有限公司,批号:C010-170502-004);杂质4(珠海优润医药科技有限公司,批号:001A20200710);杂质5(珠海优润医药科技有限公司,批号:00642-200811-01);杂质6(珠海优润医药科技有限公司,批号:001B20031101)。
1.2试剂 水(纯净水,娃哈哈)、乙腈(色谱纯,Honeywell)、氨水、磷酸二氢铵(分析纯,general-reagent)。
1.3仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪(真空脱气装置、二元泵、ALS、TCC、DAD和Chemstation工作站,Agilent公司)、色谱柱为Hypersil ODS2(4.6 mm×250 mm,5 μm)、分析天平(FA305N,上海菁海仪器有限公司)、超声仪(YM-080ST深圳市洁盟清洗设备有限公司)。
1.4色谱条件 色谱柱为Hypersil ODS2(4.6 mm×250 mm,5 μm)、流动相A为0.01 mol/L磷酸二氢铵溶液(取磷酸二氢铵1.15 g,加水溶解并稀释至1 000 mL,用氨水调节pH至6.0,经0.45 μm的微孔滤膜滤过,即得);流动相B为乙腈;流动相A到流动相B(50:50),运行时间11 min,流速为1.0 mL/min,波长为210 nm。柱温为40 ℃,进样量为10 μL。
1.5溶液的配制 (1)空白溶液(稀释剂)的配制:量取水和乙腈各500 mL,混匀即得。(2)供试品溶液的配制:取本品约20 mg,精密称定,置100 mL的量瓶中,加稀释剂适量,超声使溶解,放冷,用稀释剂稀释至刻度,摇匀即得。(3)对照品溶液的配制:取(2S,5R)-5-[(苄氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯对照品适量,精密称定,用稀释剂定量稀释制成每1 mL中约含0.2 mg的溶液,摇匀即得。(4)杂质对照品混合溶液:分别精密称取杂质1对照品、杂质2对照品、杂质3对照品、杂质4对照品、杂质5对照品和杂质6对照品适量,加稀释剂溶解并定量稀释制成每1 mL约含杂质1对照品、杂质2对照品、杂质3对照品、杂质4对照品、杂质5对照品和杂质6对照品各400 μg的混合溶液。(5)混合对照品溶液:取(2S,5R)-5-[(苄氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯供试品约20 mg,精密称定,置100 mL量瓶中,加稀释剂适量,超声使溶解,放冷至室温,加入杂质对照品混合溶液1 mL,用稀释剂稀释至刻度,摇匀,作为混合溶液。(6)标准工作液:取(2S,5R)-5-[(苄氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯对照品50 mg,精密称定,置25 mL的量瓶中,加稀释剂适量,超声使溶解,放冷至室温,加稀释剂稀释至刻度,摇匀,制成浓度约为2 mg/mL的(2S,5R)-5-[(苄氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯对照品贮备溶液。临用前用稀释剂稀释成浓度约为0.10、0.16、0.20、0.24、0.30 mg/mL的标准工作液。
2.1系统适用性试验 精密量取对照品溶液10 μL,注入色谱仪,按本研究色谱条件进行测定,记录色谱图。在该色谱条件下,对照品溶液中(2S,5R)-5-[(苄氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯色谱峰的保留时间RSD为0.10%,峰面积RSD为0.18%,理论板数按(2S,5R)-5-[(苄氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯峰计算>5 000。本方法系统适用性较好,能满足本品含量测定的系统适用性要求。
2.2专属性试验 精密量取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液和混合溶液各10 μL,注入色谱仪,按色谱条件进行测定,记录色谱图。相关图谱见图2。在该色谱条件下,供试品溶液中出现与对照品溶液中(2S,5R)-5-[(苄氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯色谱峰保留时间一致的色谱峰,且该峰峰纯度因子≥990,可认为是单一物质峰。空白、(2S,5R)-5-[(苄氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯的各杂质、供试品均不干扰供试品溶液中(2S,5R)-5-[(苄氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯测定,(2S,5R)-5-[(苄氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯与相邻峰间分离良好。本方法专属性较好,满足本品的含量测定的专属性要求。
图2 空白溶液(A),对照品溶液(B),供试品溶液(C),混合溶液(D)
2.3线性关系考察 按本方法制备的系列浓度标准工作液,注入色谱仪,按本研究色谱条件进行测定,记录色谱图,以标准工作液浓度为横坐标(X),峰面积积分值为纵坐标(Y),以最小二乘法作线性回归,绘制标准曲线,曲线不得强制过原点。回归方程为y=12.324x-78.057,r=0.999 9。结果表明,在98.069 2～294.207 7 μg/mL(相当于供试品浓度的50%～150%)浓度范围内,(2S,5R)-5-[(苄氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯具有良好线性。见图3。
图3 (2S,5R)-5-[(苄氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯线性关系图
2.4精密度试验 取(2S,5R)-5-[(苄氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯供试品,按本研究方法平行配制6份,按照本研究色谱条件分别测定,记录峰面积,计算含量,测得每1 mg供试品中(2S,5R)-5-[(苄氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯平均含量为0.994 8 mg,RSD为0.04%;另一实验人员在不同日期取(2S,5R)-5-[(苄氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯供试品,同样按本方法平行配制6份,按照色谱条件分别测定,记录峰面积,计算含量,测得每1 mg供试品中(2S,5R)-5-[(苄氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯平均含量为0.995 5 mg,RSD为0.14%;2名实验者12份供试品溶液,测得每1 mg供试品中(2S,5R)-5-[(苄氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯平均含量为0.995 2 mg,RSD为0.1%。表明本方法精密度良好。
2.5回收率试验 取本品适量,精密称定,加稀释溶解并定量稀释,制备成供试品溶液浓度的80%、100%、120%三个浓度水平的溶液,浓度分别为0.16、0.20、0.24 mg/mL,每个浓度平行配制3份。按照1.4项下色谱条件分别测定,记录峰面积,按外标法以峰面积计算每个浓度水平溶液中的(2S,5R)-5-[(苄氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯回收率(回收率%=测得量/实际加入量×100)。低浓度0.16 mg/mL、中浓度0.20 mg/mL、高浓度0.24 mg/mL 3个浓度的平均回收率(n=3)分别为99.36%、100.99%、100.56%,RSD(n=3)分别为0.20%、0.20%、1.50%;总回收率(n=9)为100.34%,RSD(n=9)为1.00%。结果表明本研究方法准确度良好,见表1。
表1 回收率结果
2.6溶液稳定性试验 按色谱条件,取同一份对照品溶液,按对照品溶液的配制,分别在0、1、5、9、11 h进样各10 μL,取同一份供试品溶液,按供试品溶液的配制,分别在0、3、5、8、11 h进样各10 μL,记录峰面积。对照品溶液,与0 h相比,各时间点主峰峰面积回收率分别为100.8%、100.7%、102.0%、101.7%,均在98.0%～102.0%;供试品溶液,与0 h相比,各时间点含量变化百分比分别为0.9%、0.1%、1.1%、1.4%,均<2.0%。对照品和供试品溶液的稳定性时限满足测定要求。
3.1分析方法色谱参数的选择 分析方法设置的色谱参数具有分析准确灵敏,所需时间较短,在浓度的范围内线性良好。实验结果表明,该分析方法的科学使用能够高度符合预期性能要求,同时具备良好的测量再现性。
3.2流动相的选择 本试验同时采用0.01 mol/L磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节pH至4.0)与乙腈以初始比例80∶20等度洗脱方式作为流动相,但试验结果显示对照品主峰出现裂峰,峰形较差,且运行时间较长。对比采用0.01 mol/L磷酸二氢铵溶液(取磷酸二氢铵1.15 g,加水溶解并稀释至1 000 mL,用氨水调节pH至6.0,经0.45 μm的微孔滤膜滤过,即得)-乙腈(50∶50)等度洗脱方式作为流动相,结果表明样品峰形最稳定,柱效最佳,保留时间适宜,且运行时间短。
3.3分析方法耐用性 在确定的色谱条件基础上,对测定条件进行较小的变动,评估测定结果不受影响的承受程度,为所建立的方法用于常规检验提供依据。结果显示。流动相pH在5.8～6.2、流速在0.9～1.1 mL/min、检测波长208～212 nm、柱温在38～42 ℃范围变动,对测定结果没有影响。
上述验证结果表明,应用本方法测定阿维巴坦起始物料的含量,系统适用性、专属性、线性和范围、检测限和定量限、精密度、准确度和耐用性等指标均符合含量测定方法验证各项要求。因此,该方法灵敏、快速、准确、可靠,能够满足阿维巴坦起始物料含量测定的日常分析要求。
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