王 卓，万 健，张玉洁，贺文芳，吴开春
(1国家消化系统疾病临床医学研究中心，消化系肿瘤整合防治全国重点实验室，空军军医大学西京消化病医院，陕西 西安 710032；
2西安医学院基础医学部组织学与胚胎学教研室，陕西 西安 710021)
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)作为慢性肠道炎症性疾病，是炎症性肠病的一种，其主要临床表现为腹痛、腹泻和便血[1]。在我国，随着社会的发展、西方化饮食的普及和生活环境的改变，UC发病率逐年提高[2-3]。然而，UC确切发病机制仍不清楚，越来越多的证据表明UC的发病和进展与肠道微生物及其代谢物(如短链脂肪酸等)的改变存在密切联系[4-6]。另有研究表明，UC患者肠道微生态的紊乱，使患者更容易受到多种细菌感染[如艰难梭菌(Clostridioidesdifficile，CD)等][7]。
CD是临床常见的机会致病菌，CD感染目前已经成为一个全球范围内严重的医学和流行病学问题[8]。近年来研究发现，CD感染是UC患者最常见的感染性并发症。目前对于UC患者CD感染的诊断，主要依赖于实验室检查，包括产毒性CD菌株的培养，CD毒素检测以及毒素基因的核酸检测[9]。然而，产毒性和非产毒性CD均可在UC患者肠道定植，通过临床症状无法准确判断患者是否存在CD感染。目前的实验室检查无法对CD感染患者和定植患者做明确区分，且很少有研究对两者做区分[10]。本研究基于UC患者合并或/和未合并CD感染患者粪便的差异菌和代谢物，建立UC存在CD感染的协助诊断模型，以期帮助临床医生快速准确地发现存在CD感染的UC患者，从而精准制定治疗策略。
1.1 对象
对2018—2019年在空军军医大学西京医院就诊的58例UC患者进行回顾性研究，其中UC未合并CD感染的患者(UCN组)29例，UC合并CD感染的患者(UCP组)29例。所有参与者均已签署知情同意，该研究经中国临床试验注册中心伦理委员会(ChiECRT20190106)批准。纳入标准：①根据病史和临床症状，结合实验室检查、内镜和组织学检查确诊的UC患者；
②CD感染的诊断标准符合《艰难梭菌感染诊断》指南[11]；
③近3个月未使用抗生素。排除标准：①处于妊娠或哺乳期的女性；
②同时诊断为其他感染性疾病、胃肠道穿孔或严重的心脏和肝脏疾病。
1.2 数据收集
由接受过统一培训的人员收集人口学特征(如年龄、性别)和身体质量指数、UC严重程度、近期用药情况；
采集患者外周血，使用全自动血生化仪器检测白细胞、血红蛋白、血沉、C-反应蛋白、血小板、D-二聚体、尿素氮和肌酐8项生化指标；
采集患者粪便，随后采用16S rRNA检测微生物菌种，用气相色谱-飞行时间谱的非靶标代谢组质谱法检测粪便代谢产物，课题组前期分析出两组间存在5种差异菌属和16种差异代谢物，记录差异菌属和代谢物相对丰度。16种差异代谢物分别是十六烷、腐胺、2，4-羟基丁酸、乳酸、氨基丙氨酸、3-羟基正赖氨酸2、4-羟基苯甲酸、3-苯基乳酸、来苏糖1、麦芽糖、槐糖2、甘露糖、尿苷2、2-脱氧尿苷、5-氢化可的松1和松柏醇。5种差异菌属包括Aggregatibacter、ClostridiumⅪ、Clostridiumsensustricto、Citrobacter和ClostridiumⅪⅤb。
1.3 统计学分析
2.1 两组患者临床一般资料比较
UCP组C-反应蛋白升高者(C-反应蛋白>6 mg/L的研究对象)占比高于UCN组，差异存在统计学意义(P<0.05)；
两组患者身体质量指数差异无显著性[(19.64±3.45)kg/m2vs(21.49±4.17)kg/m2，χ2=1.840，P=0.071]；
其余指标组间差异无显著性(表1)。
表1 两组患者一般资料比较 [n=29，n(%)]
2.2 UC患者存在CD感染的单因素和多因素分析
前期研究筛选的差异代谢物和菌属合计21种，单因素logistic回归分析发现，在差异菌属中ClostridiumⅪ在2组之间有统计学差异。在代谢物方面，十六烷、乳酸、松柏醇、3-苯基乳酸存在显著差异(P<0.05)，而其他微生物和代谢物，两组间差异无统计学意义(P>0.05，表2)。以UC是否存在CD感染为因变量，将单因素分析中P<0.05的变量设为自变量纳入多因素logistic回归分析。结果显示，十六烷低含量、乳酸和ClostridiumⅪ菌高含量是UC患者存在CD感染的独立风险因素。将三者分别作为协变量X1(十六烷)、X2(乳酸)、X3(ClostridiumⅪ)，得出的模型表达式为：logit(P)=0.724-0.980×X1+1.512×X2+1.298×X3(表2)。
表2 UC患者存在CD感染的单因素和多因素logistic回归分析
2.3 UC患者存在CD感染诊断模型的评估
根据本研究建立的诊断模型绘制ROC曲线(图1)，曲线下面积(area under the curve，AUC)为0.873(95%CI：0.782～0.964)，提示该预测模型的区分能力较好；
最佳临界值(0.655)时该模型的诊断阈值为0.411，此处敏感度为79.3%，特异度为86.2%，该模型使用Hosmer-Lemeshow拟合优度检验评估拟合效果，结果显示χ2=5.381，P=0.716，提示该预测模型校准度较好。
ROC：受试者工作特征。
近年来研究发现CD的感染能够诱发和加重UC。感染CD的UC患者药物治疗和医疗费用、紧急结肠切除术比率、住院时间、死亡率均明显增加[12]。因此，UC患者CD感染的准确判断对患者短期和长期预后的评估具有重要的临床价值，然而CD感染与定植的区分，一直没有很明确的界限，本研究应用logistic回归模型和ROC曲线建立UC患者存在CD感染的诊断模型，诊断模型ROC的AUC为0.873，灵敏度为79.3%，特异度为86.2%，提示模型区分度好。拟合优度检验χ2=5.381，P=0.716，提示模型准确性好，说明基于十六烷、乳酸和ClostridiumⅪ 3项指标构建的诊断模型对UC患者CD感染有较高的临床诊断价值，能够协助实验室检查正确诊断CD感染。
既往研究认为UC患者肠道微生物的紊乱，与CD定植和感染的机会增加有关[12-14]。同时，肠道微生物的改变与疾病状态相关[15]。已有的研究表明CD所属的ClostridiumⅪ菌属在健康人体中是普遍存在[16-17]，其中包含多种条件致病菌，如CD、索氏梭菌。该菌属也被认为是一种能够促进炎症和诱导结肠炎的细菌属[18]，是肠道有害细菌群之一。ClostridiumⅪ数目的增多与人类肠道炎症的加重相关[19]，也与小鼠肝癌发生进展存在一定联系[20]。在多种疾病的患者粪便中该菌属的数量增加[20-21]。因此，UC患者中该菌属数量的增高对UC患者存在CD感染的准确判断起到积极的提示作用。
除了肠道微生物外，微生物代谢物的改变在一定程度上也能够反映患者的疾病状态。既往研究发现肠道微生物的改变能够引起代谢物的改变[22]。本研究发现在UC合并CD感染的患者粪便代谢物中十六烷降低和乳酸升高，同时多因素分析发现十六烷和乳酸的含量高低也是UC患者CD感染的独立影响因素。
十六烷是一种碳氢化合物，烷烃类有机物。既往研究发现，在啮齿动物体内十六烷可以诱导关节炎、慢性腹膜炎和自身抗体的产生[23]，并作为佐剂诱导动物自身免疫，同时增强动物的特异性和非特异性免疫反应[24-25]。这些结果说明，十六烷可能在肠道炎性疾病的发病机制中起到一定的免疫作用，但其含量降低与UC患者CD感染之间相互联系的具体机制还有待进一步探索。
本研究诊断模型中还包含一种有机酸——乳酸。乳酸作为一种信号分子，参与葡萄糖代谢、脂肪酸合成、氧化还原稳态和蛋白质的翻译后修饰，调节人体生理状态[26]。此外，乳酸也能够参与炎症损伤，增强巨噬细胞分泌IL-6，基质金属蛋白酶1和IL-1β，增强NF-κB活性[26-27]。既往研究发现乳酸是慢性炎症组织中的信号分子，其在炎症部位的累积，可抑制T细胞的迁移，将T细胞保留在炎症部位，通过增加炎性细胞因子的产生和减少细胞溶解来延长慢性炎症，促进慢性炎症的进展[28-29]。另外，乳酸通过激活IL-23依赖性和非依赖性途径，影响肿瘤微环境，进而促进慢性炎症[30]。乳酸与RAF-ERK信号通路的激活存在一定的联系，调控炎症和血管生成[31]。乳酸的升高可能会导致机体整体或局部的炎症状态加重。课题组前期研究发现乳酸的含量与Haemophilus菌属含量有强的正相关[32]，说明乳酸的升高与该菌属中致病菌增多有关。考虑到肠道微生物与代谢物之间的联系，乳酸的改变可能与病原微生物的升高和有益菌的降低有关。乳酸在肠道堆积能够诱导慢性肠道疾病炎症加重，加重肠道微生物紊乱，从而给致病菌提供了适宜的生存条件，进一步导致或加重CD感染。本研究初次使用差异微生物和代谢物协助诊断存在CD的感染UC患者，发现差异微生物和代谢物对疾病的协助诊断潜能。
综上所述，十六烷、乳酸和ClostridiumⅪ相对含量与UC患者是否存在CD感染密切相关，使用3项指标建立UC患者CD感染的诊断模型，有良好的预测效果，为正确判断UC患者存在CD感染提供了新思路。但本研究具有样本量较少的局限性，有待未来更大样本研究加以补充和完善。该研究给予临床医师一定的启发，对于存在CD感染的UC患者在正确诊断的基础上，给予药物治疗的同时，调整肠道微生物和代谢物的种类和含量可能会有助于加快UC患者CD感染的治愈和UC的缓解。
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