王嘉威，贺永超，乔元明，许兰彬，王纪亭
（1.山东农业大学动物科技学院，山东 泰安 271000；
2.青岛诺安百特生物技术有限公司，山东 青岛）
2017年，农业部发布《全国遏制动物源细菌耐药行动计划》，明确提出要遏制动物源细菌耐药，保障养殖业生产安全、食品安全、公共卫生安全。无抗饲养可以分为三个层次，一是饲料无抗，即全品种全阶段饲料不添加抗生素；
二是养殖减抗，即养殖过程中减少使用抗生素；
三是畜产品无抗，即肉蛋品中无抗生素残留或未检出抗生素。在找寻抗生素的替代方案中，噬菌体是目前备受关注的目标之一。噬菌体作为饲料添加剂在饲料中应用的良好效果得到越来越多地关注和认可。
噬菌体是一种能特异性杀灭细菌的病毒，个体微小，只有在电镜下才能观察到它的存在。和普通的病毒一样，噬菌体不存在细胞结构，不能自身传代，必须通过微生物方可进行传代增殖。典型噬菌体基本特征包括一个衣壳包裹的头部和一个尾部（图1）。噬菌体分布较广，只要存在细菌的地方都会存在，例如：河水、土壤、空气、下水道、动物肠道，甚至南北极都存在噬菌体的身影[1]。噬菌体的发现已有百年，1915年，细菌学家Twort在做实验时发现细菌培养皿上出现空斑，认为可能是一种细菌病毒造成的，但是由于种种原因，没有继续研究下去。直到1917年，加拿大细菌学家d’Herelle，将这种吃细菌的病毒命名为“噬菌体”[2]。1919年，噬菌体首次用于治疗痢疾感染，并表现出了良好的效果。1921年，第一次报道了噬菌体用于人类葡萄球菌感染[3]。由此噬菌体治疗细菌感染进入了研究人员的视野当中，随着噬菌体治疗细菌性感染影响的逐渐扩大，噬菌体成功应用在黑死病、霍乱、痢疾等疾病的治疗[3]。1923年，Eliava微生物与病毒学噬菌体研究所成立；
1924年Oswaldo Cruz研究所在巴西成立；
美国的Eli Lilly公司等相继成立。
图1 噬菌体模式图
细菌为了自己的生存繁衍，经过了无数的代次升级，终于在2008年，瑞典“新德里1型”第一例超级耐药菌感染病例的出现，让人类意识到，抗生素这一“核弹”级武器已经让细菌产生了严重的变异。早在2017年，世界卫生组织就指出，目前正在研发的抗生素远不足以应对多重耐药性造成的感染与并发症，且耐药性增强的速度远超抗生素的研发速度[4]。《柳叶刀》报告表明，2019年有127万人直接死于耐药菌感染，495万人的死亡与细菌耐药性感染有关[5]。总之，随着抗生素的滥用以及抗药性，噬菌体疗法在治疗人类、动物中的细菌感染，甚至在食品中的生物防治方面均取得了重要进展。
自然界存在的噬菌体依据其裂解特性可分为烈性噬菌体和温和噬菌体，一般情况下只有烈性噬菌体可以用于治疗。烈性噬菌体是指注射遗传物质到细菌细胞内，能改变宿主细胞的性质，大量形成新的噬菌体，最后导致菌体裂解死亡[6]。温和噬菌体是指有的噬菌体侵入宿主细胞后，其核酸和宿主细胞同步复制，不引起宿主细胞裂解[7]。在噬菌体自发的或是某些外界环境条件（如营养、温度、pH、细菌浓度等）的诱导下，温和噬菌体也会进入裂解周期，开始裂解宿主菌[8]。
与抗生素治疗细菌性疾病相比，噬菌体用于防治疾病具有显著优势。（1）特异性高。抗生素具有广谱性，在其靶向致病菌的同时，也会破坏机体内正常的肠道菌群。噬菌体具有高度特异性，其根据本身吸附部位以及细菌表面受体结构的不同，使得一种噬菌体只针对单一或同一亚型致病菌，而不破坏动物体的正常菌群。（2）共同进化。抗生素具有广谱性，杀死敏感菌的同时，也筛选出抗性菌，抗性菌会大量增殖，从而导致抗生素失去治疗作用。噬菌体是一种“活药”，噬菌体在与细菌相互作用时，可以实现共同进化[9]，裂解耐性菌株。（3）治疗效果好。抗生素治疗不会集中于感染部位，经体内代谢失去活性，排出体外，因而时效性短。噬菌体只在感染细菌的部位增殖，少量的噬菌体就可以在感染部位大规模增殖，快速杀死致病菌。随着宿主菌的清除，噬菌体失去目标，逐渐排出体外。（4）成本小。抗生素有效作用靶点基本已被发现，所以研发新的抗生素时间长，有效性、安全性试验需要时间长、成本高。噬菌体则没有此缺点，其分布广泛、数量多，相对来说筛选是一个快速过程，筛选一种新的噬菌体通常仅需数天或数周的时间。（5）安全性好。噬菌体对人和动物细胞是安全的，不会产生毒性。（6）噬菌体与抗生素的联合应用可增强抗生素的治疗效果，也可以增强噬菌体的治疗效果[10]。（7）为了克服肉制品中大量抗生素残留，以及人畜的耐药菌感染问题，可以考虑在养殖环境喷洒特定的噬菌体，以控制疫情的发生，减少耐药菌产生的机会。
4.1 噬菌体在人类临床医疗中的应用
噬菌体首次用于人类疾病的报告是在1931年，d’Herelle描述了有关利用噬菌体治疗金黄色葡萄球菌感染的皮肤病的临床工作[11]。20世纪30年代有大量关于噬菌体应用于人类疾病的文章和专著发表[12]，其中描述了噬菌体治疗由伤寒、志贺菌属和沙门菌属引起结肠炎、腹膜炎、皮肤感染、外科手术感染、尿路感染和耳鼻咽喉感染等。然而，随着抗生素的出现，严重阻碍了噬菌体的研究进展。在美国关于噬菌体第一期临床试验是在2009年公开发表的，该试验评估了噬菌体鸡尾酒针对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌感染引起的慢性静脉腿部溃烂的治疗效果[13]。这项研究并没有显示很积极的结果，但是也没有发现噬菌体对治疗产生不利的影响。另一项随机试验是在英国进行的，研究人员利用6种噬菌体的混合溶液治疗耳部慢性感染铜绿假单胞菌的病人[14]，其中治疗组的菌落数明显减少，负责的临床医生表示病人的一些病理反应逐渐减少，如红斑、炎症、溃疡、溃疡、造粒/息肉和气味等，噬菌体制剂并没有引起不良反应。2005年，一个随机临床对照试验即给健康实验对象口服噬菌体，证明了口服噬菌体的给药方法具有较高安全性，实验对象没有产生任何毒性反应[15]。
近年来，我国也已经成立了专门用于噬菌体研究和临床转化的噬菌体与耐药研究所，但是早在20世纪80年代就有应用噬菌体治疗的成功案例。1958年，细菌学家余㵑教授应用噬菌体疗法通过噬菌体悬液清洗创面的方式成功治愈了由烧伤而引起抗生素耐药性绿脓杆菌继发感染的病例[16]。2018年上海公共卫生中心应用噬菌体疗法成功治愈了多重耐药的肺炎克雷伯菌尿路感染的病例，这是我国首例通过了医学伦理委员会审批的噬菌体治疗的案例[17]。由国内外噬菌体研究成果可见，国内外许多临床病例治愈的成果案例都证实了噬菌体疗法应用在人类临床医疗领域的安全性和可行性。噬菌体作为有可能替代抗生素的新型抗菌制剂，在人类临床医学领域表现出了很大的应用前景。
4.2 噬菌体在家禽养殖上的应用
尽管抗生素是用于家禽疾病防治的主要药物，但是由于耐药菌的不断增多，给家禽疾病的防治带来很大的难度。抗生素存在休药期，需要很长时间才能从动物体内代谢出去，时间不够，会导致抗生素残留在肉、蛋、奶等食品中，引发食品安全问题，所以噬菌体的深入研究及其在养殖场的广泛应用就显得尤为重要。经过百年的发展，噬菌体用于防治禽细菌感染性疾病也有了广泛的报道，其既可用于敏感病菌也可用于对抗生素产生耐性的病菌[18]。目前普遍可用于防治禽致病性大肠杆菌、禽金黄色葡萄球菌、禽沙门菌病、禽弯曲杆菌病、梭状芽孢杆菌病等细菌疾病[19]。噬菌体可以在环境中保持相对稳定，并存活一定的时间，所以除了可以用于畜禽疾病的防治，噬菌体制剂还可以用于环境改良剂，减少环境中的细菌，降低动物患病的风险[20]。据报道，噬菌体在防治禽细菌性疾病的效果不弱于抗生素。将噬菌体制剂用于被大肠杆菌感染且对抗生素耐药性严重的鸡场，在使用噬菌体治疗7 d后，雏鸡死亡率快速降低，第21天后，彻底治愈，且没有出现复发情况[21]。噬菌体用于禽大肠杆菌以及沙门菌预防以及治疗，分别在3个时间点从肉鸡不同器官取样，发现噬菌体处理组的各器官中，致病菌含量很低，表明噬菌体对鸡场中大肠杆菌病和沙门菌病的治疗和预防具有良好的效果[22]。2019年Clavijo首次将噬菌体应用于大型家禽生产系统中，可将禽体内沙门菌菌量降低200倍，在肉鸡第33天，肠道内沙门菌被彻底清除，家禽饲料转化率提高，死亡率大幅降低[23]。Huang等人（2022年）评估了沙门氏菌噬菌体CKT1对高毒性关节炎白痢沙门氏菌的治疗效果，结果表明，沙门氏菌噬菌体CKT1可以通过调节肠道微生物群，提高雏鸡的生长性能[24]。噬菌体疗法对于控制畜牧养殖业中的细菌感染效果良好，而且在控制机体本身的细菌感染同时又提高了动物性产品的质量，降低动物源性产品造成人类食源性细菌感染的可能性。
4.3 噬菌体在饲料添加剂上的应用
噬菌体除了可以用于治疗细菌性疾病之外还可以用作饲料添加剂。禁用饲料添加抗生素以来，动物的生长性能受到明显影响。很多学者认为噬菌体是很好的替代品。作为饲料添加剂，噬菌体具有安全性高，提高生长性能，调节肠道菌群保持相对稳定，提高畜禽免疫力等优势。Wang等人在日粮中添加0.5 g/kg的噬菌体作为饲料添加剂，发现可以提高肉鸡饲料利用率以及免疫器官指数，还可以抑制体内病原菌[25]。使用噬菌体添加日粮喂养仔猪，噬菌体可以调节肉猪肠道菌群，增加肠道内有益菌数量，减少病原菌[26]。噬菌体添加到饮水中，肉鸡生长性能显著提高，促进肠道稳态，改善肠道菌群[27]。唐路遥（2022）研究表明，噬菌体鸡尾酒可以提高肉鸡生长性能，改善肠黏膜结构，促进肠道菌群平衡，研究证明噬菌体鸡尾酒是替代抗生素产品的有效选择之一[28]。近年来，噬菌体制剂作为安全绿色的替抗产品在畜牧行业中的应用越来越广泛。2013年在畜禽养殖方面，美国Intralytix公司研发的针对产气荚膜梭菌的噬菌体制剂INT-401已被FDA授权用于消除活禽养殖中细菌感染。2013年在畜禽产品加工方面，由美国Intralytix公司研发的针对沙门氏菌的噬菌体制剂SalmoFresh™被FDA认定为公认安全级产品（Generally Regarded As Safe,GRAS），并获批准上市。伴随着减抗替抗、无抗时代的到来，诺安百特研发的诺安益康饲料添加剂产品也已推出市场。
4.4 噬菌体在食品生物控制中的应用
食品作为人类日常生活的必需品，食品卫生安全跟人类的健康是息息相关。食品中应杜绝病原微生物的出现，但是目前由病原体引起的几种食源性病原菌（如沙门菌、大肠杆菌和其他对公共卫生有巨大影响的病原菌）引发的疾病也持续存在，因为污染细菌可以在屠宰、挤奶、发酵、加工、储存或包装过程中接触到食物。在过去几年中，由于抗生素以及消毒剂的广泛使用导致的耐药性问题，迫使人们开始探索一些将原料产品的微生物载量降至更低的策略。另一方面，食品工业中经常使用的一些减少食源性病原菌污染的方法并不能直接应用于新鲜水果、蔬菜和即食食品。因此仍需要新的策略来满足消费者对食品卫生的要求。
噬菌体除了适用于防止或减少家畜中的疾病（噬菌体疗法），还可以用于净化胴体和其他原产品，如新鲜水果和蔬菜，以及对设备和接触面进行消毒（噬菌体生物监控和生物控制）和延长易腐加工食品作为天然防腐剂的保质期（生物防腐剂）。噬菌体可以减少食品和食品加工环境中微生物污染，不仅能够减少经济损失还可以大大减少人类发生食源性感染的可能性[29]。因此，开发商品化噬菌体是值得政府大力支持和推广的。目前，美国FDA已经允许多种噬菌体制剂在食品加工中的应用。
噬菌体存在很多优势，但也存在一些不足之处。（1）稳定性差。由于噬菌体结构的不稳定性，所以噬菌体制剂的保存和运输具有严格的要求。（2）噬菌体在作用于细菌后，细菌发生裂解，引起内毒素释放，且内毒素不易被清除。（3）口服给药时，胃内强酸环境影响噬菌体制剂的稳定性，引起噬菌体效价下降，同时用药之后，噬菌体会进入身体循环系统，引起机体免疫反应，产生中和抗体，从而抑制噬菌体发挥作用。（4）使用单一噬菌体后，会很快产生抗性菌株，从而失去作用。
针对噬菌体疗法存在一些不足之处，提出了以下具体解决方案。（1）多种噬菌体混合使用制成噬菌体鸡尾酒。其可以对多种感染细菌产生裂解作用，扩大裂解谱。宿主菌通过突变等方式对单一噬菌体产生抗性，而鸡尾酒中有多种噬菌体，存在不同作用靶点，在一定程度上解决了抗性菌株存在的问题。（2）在噬菌体制剂中添加稳定剂，或将噬菌体颗粒冻干，或将噬菌体制成软膏，便于保存，解决噬菌体稳定性差、难保存的问题。（3）口服给药后胃内胃酸会影响噬菌体稳定性。可以在噬菌体制剂中制成胶囊等包裹噬菌体，提高噬菌体制剂的抗酸能力。（4）噬菌体用药后，引发机体免疫反应中和噬菌体。可以增加噬菌体制剂用药频次、用药浓度以及噬菌体鸡尾酒等方式，使噬菌体在机体内存在时间延长，浓度增加。综上所述，噬菌体是一种很有前景的已经被广泛应用于各个领域的抗菌制剂。
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