邹淼，刘顺鑫，冯静，韩晓鸥
（辽宁省疾病预防控制中心，沈阳 110005）
氯酸盐是使用含氯消毒剂消毒时产生的副产物，会阻碍甲状腺对碘的吸收，还会破坏红血球，引起贫血症及高铁性血红蛋白血症，导致呼吸困难[1]。高氯酸盐化学性质稳定，溶解度高，具有一定的持久性和扩散性。高氯酸盐由于和碘离子拥有相似的离子半径及电荷，能够抑制碘的吸收，影响人体甲状腺功能，导致功能紊乱，对孕妇和婴幼儿影响更大[2]。随着氯酸盐和高氯酸盐进入环境，迁移至土壤和水体中，被水生物、植物体吸收、富集，通过食物链最终进入人体，威胁人类健康[3]。蔬菜是人们日常所需食物，为人体提供必需的维生素和矿物质等，其在生长及运输的过程富集土壤、水体中的污染物，通过饮食摄入影响人体健康。目前已有报道，在大米、蔬菜、水果等产品中均有氯酸盐和高氯酸盐的检出，为保障人民群众舌尖上的安全，对蔬菜中氯酸盐及高氯酸盐的检测非常必要。当前对于蔬菜中高氯酸盐的检测研究较多，而对于氯酸盐和高氯酸盐同时快速检测较少，因此，建立高效、准确的方法同时检测食品中氯酸盐和高氯酸盐残留具有重要意义。
现有的氯酸盐和高氯酸盐检测方法有离子色谱法[4-5]、离子色谱-串联质谱法[6-7]及液相色谱-串联质谱法[8-9]等。离子色谱法当样品基质复杂时容易出现假阳性；
离子色谱-串联质谱法普及率较低；
超高效液相色谱-串联质谱法具有抗干扰能力强，分析速度快，灵敏度高，避免基质干扰的优点，因而得到普遍应用。
笔者以少量水稀释分散样品，用乙腈提取，然后用PRⅠME HLB 固相萃取柱净化，以同位素内标法定量，建立超高效液相色谱-串联质谱法同时测定蔬菜中氯酸盐和高氯酸的快速检测方法，为了解我国蔬菜中氯酸盐和高氯酸盐的残留水平提供参考。
1.1 主要仪器与试剂
超高效液相色谱串联质谱仪：Acquity Xevo TQ型，美国沃特世公司。
台式高速冷冻离心机：ST16R型，美国赛默飞世尔科技公司。
多用途漩涡混合器：Vortex genie2 型，美国Scientific Ⅰndustries公司。
固相萃取仪：Vac Elut SPS 24型，美国安捷伦科技有限公司。
固相萃取柱：PRⅠME HLB 型，200 mg (6 mL)，美国沃特世公司。
氯酸盐标准溶液：1 004 μg/mL (以ClO3-计)，标准物质编号为SB05-223-2008，农业部环境保护科研检测所。
高氯酸盐(ClO4-)标准溶液、氯酸盐(Cl18O3-)内标标准溶液、高氯酸盐(Cl18O4-)内标标准溶液：质量浓度均为100 μg/mL，美国Cambridge Ⅰsotope Laboratories公司。
乙腈：色谱纯，美国赛默飞世尔科技公司。
实验用水为超纯水，由Milli-Q纯水系统制得。
1.2 实验方法
1.2.1 标准溶液的配制
混合标准中间液：其中含有1.0 μg/mL ClO4-和2.0 μg/mL ClO3-。分别准确移取100 μL 高氯酸盐标准溶液和20 μL氯酸盐标准溶液至10 mL容量瓶中，用超纯水定容至标线，混匀。
混合同位素内标使用液：其中含有1.0 μg/mL Cl18O4-和10 μg/mL Cl18O3-。分别准确移取100 μL高氯酸盐内标标准溶液和1 000 μL 氯酸盐内标标准溶液至10 mL 容量瓶中，用超纯水定容至标线，混匀。
系列混合标准工作溶液：高氯酸盐质量浓度分别为0.00、1.00、2.00、5.00、10.0、20.0、50.0 ng/mL，氯酸盐质量浓度分别为0.00、2.00、4.00、10.0、20.0、40.0、100 ng/mL，同位素内标Cl18O4-和Cl18O3-质量浓度分别为5.0、50 ng/mL。分别准确移取适量的混合标准中间液至7 只10 mL 容量瓶中，每只容量瓶中加入50 μL混合同位素内标使用液，用乙酸铵-乙腈溶液(体积比为1∶2)稀释并定容，混匀。
1.3 仪器工作条件
1.3.1 色谱仪
色谱柱：Waters Torus DEA柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美国沃特世公司)；
柱温：35 ℃；
进样体积：10 μL；
流动相：(A) 20 mmoL/L 乙酸铵溶液，(B)乙腈，流量为0.3 mL/min；
淋洗方式：梯度洗脱，洗脱程序见表1。
表1 梯度洗脱条件Tab.1 Gradient elution conditions
1.3.2 质谱仪
电离方式：ESⅠ-；
离子源温度：150 ℃；
毛细管电压：3.0 kV；
脱溶剂气温度：500 ℃；
脱溶剂气流量：800 L/h；
锥孔反吹气流量：50 L/h。氯酸盐和高氯酸盐及内标质谱参数见表2。
表2 氯酸盐和高氯酸盐及内标质谱参数Tab.2 Parameters of mass spectra of chlorate and perchlorate and internal standard
1.4 样品处理
准确称取2 g蔬菜样品于50 mL离心管中，加入100 μL 混合同位素内标使用液，加入7.0 mL 超纯水，涡旋振荡提取5 min，再加入13.0 mL 乙腈，混匀，超声30 min，以10 000 r/min转速离心10 min，取上清液，待净化。移取3.0 mL 上清液，过PRⅠME HLB固相萃取柱，弃去前1 mL初滤液，收集约1 mL续滤液，过0.22 μm再生纤维滤膜，上机测定。
1.5 样品测定
取上述样品溶液，在1.3 仪器工作条件下测定，以色谱峰面积内标法定量。
2.1 质谱条件优化
氯酸盐、高氯酸盐及其内标物为含有强阴离子酸根的盐类，选择负离子模式下进行全扫描，确定ClO3-、ClO4-、Cl18O3-、Cl18O4-的母离子子离子见表2，与文献报道的结果一致[10-12]。以上述4 种目标化合物的分子离子峰为母离子，进行子离子扫描，同时对质谱条件进行优化，选取互不干扰且响应最高的两个离子峰作为子离子，其中响应较高的作为定量子离子，另一个作为定性子离子。
2.2 色谱条件优化
氯酸盐及高氯酸盐是强极性的离子化合物，常用的C18反相色谱柱很难将其完全分离，因此采用Waters Torus DEA 色谱柱，该色谱柱填料的键合相能对氯酸根和高氯酸根实现快速、稳定的分离，同时解决了离子交换柱不能应用有机相作为流动相的缺点。在实际测样过程中，由于基质的不同，对目标化合物会有不同程度的抑制，等度洗脱很难满足实验要求，故需采用梯度洗脱方式。以20 mmoL/L乙酸铵溶液为流动相A，乙腈为流动相B，流量设定为0.3 mL/min，进行梯度洗脱，氯酸盐、高氯酸盐的灵敏度、峰形均能满足分析要求，具有特异性强，假阳性少的优点。氯酸盐及高氯酸盐的MRM提取离子流图见图1。
图1 氯酸盐及高氯酸盐的MRM提取离子流图Fig.1 MRM Chromatogram of chlorate and perchlorate
2.3 样品处理条件优化
2.3.1 提取试剂的选择
氯酸盐、高氯酸盐都属于无机阴离子，有较好的水溶性，因此，蔬菜样品取样后，先加入少量水稀释分散后再加入有机溶剂提取。实验比较了水-乙腈(体积比11∶9)、水-乙腈(体积比1∶1)、水-乙腈(体积比7∶13)、乙腈的提取效率，结果表明，用乙腈提取时，回收率不稳定波动较大，随着水比例的增加，提取率趋于稳定，但是当乙腈比例的减少一定程度时，提取效率开始降低，结果见图2。乙腈作为提取试剂，具有一定的组织穿透能力，对于蔬菜提取是较好的选择。水-乙腈(体积比7∶13)的提取效率较高且稳定，因此选取水-乙腈(体积比7∶13)作为提取试剂。
2.3.2 固相萃取柱的选择
对比了C18柱、WAX柱、PRⅠME HLB柱3种固相萃取小柱的净化效果，结果表明，C18柱与PRiME HLB 柱的回收率无显著性差异，而应用WAX 柱回收率相对较低，在70%左右(见图3)。同时，PRiME HLB柱操作简便，无需活化，节约试剂，是快速检测的最佳选择。为简便操作，选取PRiME HLB固相萃取柱作为净化柱。此外，还对过柱后的初滤液与续滤液进行了对比，发现对于氯酸盐，其初滤液和续滤液结果存在显著性差异，而高氯酸盐无此差异，这与张文婷等[13]的研究结果基本一致，因此，应弃去前1 mL的初滤液，收集续滤液用于测定，以保证氯酸盐检测结果的正确性。
图3 氯酸盐和高氯酸盐在不同固相萃取柱上的平均回收率Fig.3 Average recoveries of chlorate and perchlorate on different solid phase extraction columns
2.4 内标物的选择
利用液相色谱-串联质谱法测定时，目标化合物容易受到来自样品基质的干扰，产生基质效应。常见的降低基质效应的方法有同位素内标法、基质匹配曲线法和减小进样量等[14-15]。同位素内标有着与目标化合物相似的理化性质，能够补偿由基质效应引起的信号改变。实验根据氯酸盐和高氯酸盐的性质选取内标物，氯酸盐以Cl18O3-为内标，高氯酸盐以为Cl18O4-内标，结果表明，以上述2种同位素为内标时，可获得准确可靠的实验结果。
2.5 线性范围和检出限
在实验条件下分别测定系列混合标准工作溶液，分别以氯酸盐、高氯酸盐的质量浓度为横坐标，以氯酸盐、高氯酸盐与相应同位素内标物的色谱峰面积比为纵坐标，绘制标准工作曲线，以3倍信噪比对应的氯酸盐、高氯酸盐质量浓度作为方法检出限，以10倍信噪比对应的氯酸盐、高氯酸盐质量浓度作为方法定量限，氯酸盐、高氯酸盐的质量浓度线性范围、线性方程、相关系数和检出限、定量限见表3。
表3 氯酸盐、高氯酸盐的线性关系、相关系数、检出限、定量限Tab.3 Linear relationship， correlation coefficients， detection limits， and limit of quantitation of chlorate and perchlorate
2.6 样品加标回收试验
选取3 组蔬菜阴性样品，每组6 份，分别加入混合标准中间液及混合同位素内标使用液，混匀，静置，使其充分混合，然后利用该实验方法进行样品处理，上机测定，测定结果见表4。由表4 可知，氯酸盐、高氯酸盐的平均回收率为88.9%～97.1%，相对标准偏差为2.9%～7.4%(n=6)，回收率和精密度均满足实际样品测定的要求。
表4 样品加标回收试验结果Tab.4 Recovery results of spiked samples
采用Waters Torus DEA 色谱柱，少量水稀释分散，乙腈提取，PRⅠME HLB固相萃取柱净化，结合同位素内标法进行定量，建立超高效液相色谱-串联质谱法测定蔬菜中氯酸盐和高氯酸盐。与其他实验方法相比，选用合适比例的水-乙腈保证提取效率，采用PRⅠME HLB 固相萃取柱简化净化步骤，应用同位素内标降低基质效应，使得蔬菜中氯酸盐及高氯酸盐的检测更加准确，便捷，高效，具有良好的精密度和回收率，适用于蔬菜中氯酸盐及高氯酸的大批量快速检测。
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