于大鹏 ,丁友鹏 ,李勉洲 ,张荣远,2
1济宁市第一人民医院泌尿外科 山东省济宁市,272100
2香港中文大学深圳研究院 广东省深圳市,518172
慢性肾脏病 (chronic kidney disease,CKD)是一个主要的公共卫生问题,在一般人群中的总患病率约为14 %。CKD 的特征是由肾单位功能进行性丧失引起的肾脏滤过功能受损,肾单位被间质纤维化所取代。肾损伤的发生和进展与多种分子事件有关,如离子蓄积、线粒体功能障碍、氧化应激活化、炎症和细胞凋亡[1]。虽然许多细胞活动与肾脏损伤有关,但活性氧 (reactive oxygen species,ROS) 被证明是关键的介质,因为ROS 清除的增强可以缓解肾脏损伤[2-3]。以前的研究表明,减轻氧化应激能够减轻肾脏损伤[4]。因此,找到减少肾损伤产生的氧化应激的策略越来越有意义。
microRNA (miRNA) 是一类短的内源性非编码单链RNA,含有21～25 个核苷酸。它们通过靶向特定的mRNA 来破坏mRNA 的稳定性,抑制蛋白质产生和沉默翻译,在基因表达转录后发挥关键的调节作用[5]。凭借这种强大的调节功能,miRNA与各种生物过程相关,包括增殖、分化和细胞凋亡[6-7]。大量证据表明,miRNA 参与许多疾病的发病机制,可以修饰基因表达[8],并且已经发现miRNA 失调与主要肾脏疾病相关[9]。尽管先前的研究已表明miRNA 在调节肾脏生理功能和肾稳态中的重要性,但这种miRNA 的确切身份在很大程度上仍然未知。因此,了解miRNA 在肾损伤发病机制中的潜在分子机制可能有助于开发治疗和预防肾损伤的先进药物治疗方法。
高草酸尿症是草酸盐晶体发生的主要危险因素之一。高草酸尿症可能受特定饮食[10](如素食主义) 或肠道微生物组成的影响[11]。目前,人们普遍认为这些晶体会诱发肾结石和全身性疾病,包括慢性肾脏疾病和肾功能衰竭、代谢紊乱和心血管疾病[12]。
在这项研究中,我们利用草酸钠诱导的HK-2细胞模型,研究miRNA-30b-3p 靶向ZNRF1 调控HK-2 细胞凋亡和氧化应激的影响。
1.1 细胞培养
正常原代肾小管HK-2 细胞系购自中国型培养中心。HK-2 细胞在RPMI 1640 培养基中与10 %胎牛血清在37 ℃,5 % CO2的细胞加湿培养箱中进行培养,当细胞汇合度达到80 % 时,将草酸钠(0.2、0.6 μmol/L) 分别加入HK-2 细胞中进行研究。
1.2 细胞转染
消化并收集对数生长阶段的HK-2 细胞,按照密度为1 ×106个/孔接种到六孔板中。培养24 h后,根据试剂盒操作方案,使用LipofectamineTM2000 转染试剂将miR-30b-3p mimic 和miR-30b-3p inhibitor 及其相对应的对照组转染到HK-2 细胞中。
1.3 CCK-8
将相对应组别的细胞并以1 ×104个/孔的密度接种到96 孔板中。每组细胞设置有3 个重复孔。在细胞孵育0、24、48 和72 h 后,向每个孔中加入20 μL 的CCK-8 试剂。通过自动酶标记物检测A450nm,该标记物评估活细胞的数量。
1.4 靶标预测和荧光素酶测定
TargetScan 在线工具 (http://www.targetscan.org/vert_ 72) 预测miR-30b-3p 潜在的靶基因。为了确认miR-30b-3p 和ZNRF1 在HK-2 细胞中的相互作用,将HK-2 细胞按照4 ×104个/孔接种到六孔板中,并在37 ℃下培养24 h。随后,将HK-2 细胞的野生型(WT) 和突变型(MUT)3′-UTR 克隆到荧光素酶报告载体PsiCheck2 中。MUT 序列使用定点诱变试剂盒生成。根据制造商的方案,将WT 和MUT HK-2 细胞荧光素酶质粒(100 ng) 与miR-30b-3p 和相应的NC 共转染到HK-2 细胞中。在37 ℃孵育48 h 后,使用双荧光素酶报告检测系统测量相对荧光素酶活性,萤火虫荧光素酶活性被标准化为雷尼拉萤光素酶活性。
1.5 蛋白质印迹分析
将样品在含有3.1 mmol/L 蔗糖、1 mmol/L 二硫苏糖醇、10 μg/mL 亮肽素、10 μg/mL 大豆胰蛋白酶抑制剂、2 μg/mL 抑肽酶和0.1 % Triton X-100 的50 mmol/L 裂解缓冲液(pH 7.4) 中在冰上超声处理5 s。将匀浆在4 ℃下以5 000 r/min 离心20 min,收集上清液。使用BCA 试剂盒测量总蛋白质浓度。使用12 % SDS-PAGE 分离蛋白质裂解物(20 μg) 并转移到聚偏二氟乙烯膜上。用5 %脱脂牛奶封闭后,将聚偏二氟乙烯膜与一抗孵育。在TBS-T 中洗涤膜(10 min×3),然后用适当的二抗(1∶10 000)。膜使用VersaDoc 5000 开发,条带密度用Quantity One 4.6 软件测量,通过兔多克隆抗体测量GAPDH 水平。
1.6 酶联免疫吸附测定(ELISA)
乳酸脱氢酶 (lactate dehydrogenase,LDH)、丙二醛 (malondialdehyde,MDA) 和谷胱甘肽(glutathione,GSH) 根据试剂盒说明书测量细胞培养上清液中LDH、MDA 和GSH 的水平。
1.7 流式细胞术测量细胞内ROS
将HK-2 细胞培养在六孔板中,并用草酸钠处理。收获HK-2 细胞并用DCFH-DA (2,7-二氯荧光素二乙酸酯) 处理0.5 h,然后用PBS 洗涤,并通过流式细胞术分别在485 nm 和538 nm 处激发和发射测量细胞内ROS 的产生。
1.8 Transwell
在Transwell 板的上室涂覆1 mg/mL 的基质胶,并在下室中加入DMEM (dulbecco’s modified eagle medium) 培养基。将2 ×105个HK-2 细胞接种在上室并在室内温度下培养。将渗入下腔室的细胞固定并用结晶紫染色。将随机选择的字段置于显微镜下进行计数。
1.9 划痕实验
用100 μL 移液器吸头刮除接种在六孔板上的每组细胞,以产生两个没有细胞的线性区域,用考马斯亮蓝染色细胞,并使用ImagePro 6.0 在不同时间点对两个线性区域之间的划痕距离进行成像和测量,选择每个孔中的5 个随机非重叠图像并进行定量以进行统计分析。
1.10 统计学分析
所有数据均表示为平均值±标准差。使用单因素方差分析对多组进行比较,当方差均匀时,使用最不显著差异T(LSD-t) 检验。所有获得的数据均使用GraphPad v7.0 软件进行统计分析。
2.1 草酸钠诱导的HK-2 细胞氧化应激损伤
为研究草酸钠对HK-2 细胞氧化损伤的影响,本研究采用不同浓度的草酸钠(0.2 μmol/L,0.6 μmol/L) 处理HK-2 细胞48 h,我们发现草酸钠处理HK-2 显著增加了ROS 生成(P＜0.01),LDH释放 (P＜0.01),细胞MDA 明显增加 (P＜0.01),GSH 含量明显降低(P＜0.01),且都与草酸钠的浓度呈现剂量依赖关系(图1)。
图1 草酸钠诱导HK-2 细胞氧化应激损伤
2.2 草酸钠诱导对HK-2 细胞增殖凋亡,迁移及侵袭的影响
为研究草酸钠对HK-2 细胞增殖凋亡,迁移及侵袭的影响,本研究采用CCK-8 法检测HK-2 细胞的增殖情况(图2A),Transwell 检查HK-2 细胞的侵袭个数(图2B),划痕试验检查其迁移率(图2C),蛋白质印迹检测Bax 和Bcl-2 的蛋白表达水平反映HK-2 细胞的凋亡情况(图2D),由图2 结果可知,与Control 组相比,草酸钠组HK-2 细胞的增殖、侵袭、迁移能力明显受到抑制(P＜0.01),但是促进其凋亡能力(P＜0.01),且随着草酸钠的浓度的增加作用更加明显。
图2 草酸钠诱导对HK-2 细胞增殖凋亡,迁移及侵袭的影响
2.3 miR-30b-3p 促进HK-2 细胞中草酸钠诱导的氧化应激损伤
为了确定草酸钠是否影响HK-2 细胞中miRNA的表达水平,我们测定了用0.2、0.6 μmol/L 的草酸钠处理的HK-2 细胞中的miRNA 水平。结果发现,与Control 组相比,草酸钠组的miR-30b-3p 显著上调;因此,我们选择miR-30b-3p 作为感兴趣的miRNA 进行研究,结果表明miR-30b-3p inhibitor 组的miR-30b-3p 显著降低(P＜0.01),表明细胞转染成功(图3)。图4 结果表明,miR-30b-3p inhibitor 治疗显著降低了ROS 生成,减少了LDH释放,降低了MDA 水平,同时增加了HK-2 细胞中GSH 的含量,但这种影响因为有草酸钠的存在而降低miR-30b-3p inhibitor 治疗效果。
图3 miR-30b-3p 的相对表达水平
图4 miR-30b-3p 促进HK-2 细胞中草酸钠诱导的氧化应激损伤
2.4 ZNRF1 是HK-2 细胞中miR-30b-3p 的直接靶标
根据StarBase v2.0 网站 (http://starbase.sysu.edu.cn/starbase2/) 在线分析的结果,预测ZNRF1 是miR-30b-3p 的靶标,在其3′-UTR,在ZNRF1 基因中发现了miR-30b-3p 的结合位点,并利用荧光素酶报告基因检测miR-30b-3p 与ZNRF1之间的相互作用。双荧光素酶报告基因检测结果表明,ZNRF1-WT 组中的荧光素酶活性因miR-30b-3p的表达水平上调而降低,然而,MUT 组的荧光素酶活性没有显著变化(P＞0.05),ZNRF1 可能是miR-30b-3p 的直接靶标,图5D 结果表明miR-30b-3p 靶向ZNRF1 呈负相关调节。
图5 ZNRF1 是HK-2 细胞中miR-30b-3p 的直接靶标
2.5 沉默ZNRF1 逆转miR-30b-3p 抑制剂对的HK-2 细胞氧化应激的保护作用
草酸钠处理的HK-2 细胞的RT-qPCR 分析显示ZNRF1 表达以剂量依赖性方式下调,显示转染si-ZNRF1 成功(图6)。我们在细胞中si-ZNRF1 进行了miR-30b-3p 抑制剂的组合实验,结果表明0.6 μmol/L+inhibitor+si-ZNRF1 组与0.6 μmol/L+inhibitor+si-NC 组相比,ROS 含量,LDH、MDA 含量明显升高(P＜0.01),GSH 水平显著降低 (P＜0.01)(图7)。这种结果表明沉默ZNRF1 逆转miR-30b-3p 抑制剂对的HK-2 细胞氧化应激的保护作用。
图6 ZNRF1 的相对表达水平
图7 沉默ZNRF1 逆转miR-30b-3p 抑制剂对的HK-2 细胞氧化应激的保护作用
2.6 沉默ZNRF1 逆转miR-30b-3p 抑制剂对的HK-2 细胞损伤的保护作用
为了进一步验证ZNRF1 参与miR-30b-3p 对HK-2 的保护作用,我们在细胞中沉默ZNRF1,然后与miR-30b-3p 抑制剂组合实验。结果发现,与0.6 μmol/L+miR-30b-3p inhibitor +si-NC 组相比,0.6 μmol/L+miR-30b-3p inhibitor+si-ZNRF1 组中HK-2 细胞的增殖能力降低(P＜0.01),侵袭和迁移能力降低(P＜0.01),凋亡能力上升(P＜0.01) (图8)。
图8 沉默ZNRF1 逆转miR-30b-3p 抑制剂对HK-2 细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响
以上结果表明沉默ZNRF1 逆转miR-30b-3p 抑制剂对草酸钠诱导的HK-2 的保护作用。
慢性肾脏病是我国常见慢性病之一,目前慢性肾脏病是全球死亡率中排第11 位的疾病[13],部分原因是心血管并发症[14],考虑到疾病的负担和临床意义,对肾脏疾病的治疗和研究已然成为现代医药和制药工业的主要目标。
在本研究中,我们通过研究miR-30b-3p 促进HK-2 细胞中草酸钠诱导的氧化应激损伤,表明miR-30b-3p 可能是草酸钠诱导的HK-2 细胞的临床标志物。在哺乳动物中,尽管饮食摄入量很大,但血清中草酸盐的浓度仍然很低;然而,在肾小球滤过液中,草酸盐浓度可能变得相当高。随着水的重吸收,管状系统中的草酸盐浓度上升到饱和点以上(过饱和度),草酸盐形成草酸钙晶体[15]。虽然肾结石的主要成分是草酸钙,但是机体摄入的草酸盐量过高更容易形成结石。肾脏中ROS 增加会导致肾小管细胞发炎和损伤,从而促进草酸盐晶体的形成。氧化应激是ROS 的产生超出了抗氧化酶(如超氧化物歧化酶) 的保护能力。近年来,氧化应激在肾结石形成中的作用越来越受到关注[16-17]。越来越多的证据表明,氧化应激诱导的肾损伤可能是在较高的草酸盐浓度下促进草酸盐晶体在肾脏中沉积的关键因素,我们的研究发现,草酸钠在高浓度下,ROS、LDH 和MDA 的水平明显增高,GSH的含量显著降低,与之前他人的论证结果一致,草酸盐晶体在肾脏中沉积还可能通过线粒体破坏诱导细胞凋亡。此外,许多研究还表明,通过体内抗氧化治疗可以显著降低肾草酸盐晶体沉积[18-19]。
众所周知,miRNA 在细胞生物学的各种过程中起着关键作用。许多研究人员发现miRNA 在肾结石的发病机制中起着重要作用[20]。我们的结果表明,HK-2 细胞中的草酸盐显著增加了miR-30b-3p 的水平。我们还发现miR-30b-3p 过表达显著增加了ROS 生成、LDH 释放和细胞MDA 水平,降低了GSH 的含量,而miR-30b-3p 抑制剂具有相反的效果。以上所有结果表明,miR-30b-3p 敲低显著逆转了草酸钠通过直接靶向ZNRF1 的3′-UTR 区域诱导HK-2 细胞中的氧化应激反应。
ROS 是神经元死亡的主要诱因,ROS 通过神经元凋亡和轴突变性激活ZNRF1,ZNRF1 是一种靶向神经元中AKT 的泛素连接酶[21]。ZNRF1 通过UPS 降解AKT 来促进氧化应激诱导的神经元凋亡,氧化应激诱导ZNRF1 在第103 个酪氨酸残基(Y103) 处磷酸化,从而增加其泛素连接酶的活性,以靶向神经元中的AKT 蛋白。抗磷酸化突变体ZNRF1 Y103F 的过表达保护神经元免受6-羟基多巴胺(6OHDA) 诱导的细胞凋亡,其程度类似于显性阴性突变体ZNRF1 C184A[22]。
总之,我们的研究结果表明miR-30b-3p 敲低抑制体外的ZNRF1 表达,从而保护肾脏免受草酸钠诱导的细胞凋亡和氧化应激损伤,抑制HK-2 细胞增殖、侵袭和迁移。综上所述,miR-30b-3p 可作为草酸钠患者的潜在靶标。
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