丁海生，王源朗，程广龙，赵辉玲，黄冬维
（安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，畜禽产品安全工程安徽省重点实验室，合肥 230031）
长毛兔是以产毛为主要用途的家兔，其被毛长厚、体表汗腺少，容易受到季节变化，特别是夏季高温高湿的影响而产生应激，轻则采食量下降、生产性能降低，重则健康受损，甚至死亡［1-2］。现有的研究表明，长毛兔夏季的产毛量均大幅低于非热应激时的产毛量［3-5］，且死亡率增高，皮肤毛囊萎缩严重，毛囊细胞凋亡明显［6］。通过气候室模拟季节气候变化，发现不同温度条件显著影响德系长毛兔兔毛及其髓腔的直径，温度越高，直径越小［7］。而长毛兔繁殖性能也容易受到季节性变化的影响，公兔甚至出现“夏季不育”［8-9］。研究表明，长毛兔公兔在夏季高温条件下精子活力下降、密度降低、有效精子数减少，畸形率升高，持续高温则出现无精期［8］；
德系长毛兔公兔无论在自然热应激还是人工热应激环境，其精液量和品质均会严重下降［10］。长毛兔母兔在高温季节采食量会下降，容易造成营养不足。由于毛长散热困难，25℃以上掉膘消瘦到一定程度就容易发生流产［11］。
长毛兔的生产性能随季节（热应激）变化的同时，其生理生化指标也发生相应的变化。环境高温可导致长毛兔体温升高［3］，特别是公兔阴囊和直肠温度显著升高，导致精液品质下降［8］。而处于夏季热应激的长毛兔精清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）较高，其中AST 与精子畸形率呈显著正相关［10］。顾剑［4］研究发现，热应激会导致长毛兔全血淋巴细胞明显降低，嗜中性粒细胞数增加，血清葡萄糖、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、胆固醇和甘油三酯含量显著增加，抗氧化指标显著降低。此外，有关长毛兔的研究鲜见报道。血液是动物内环境的重要组成，血液生化水平可反映和影响家畜机体的健康、新陈代谢状况及生产性能表现［12］。因此，本研究通过对比分析春、夏、秋3 个季节长毛兔血清生化指标的变化差异，旨在筛选受热应激影响的潜在血清指标，从而为指导长毛兔生产提供参考。
1.1 试验动物及采样
试验所用成年长毛兔来自安徽省农业科学院长毛兔育种基地（绩溪），饲养管理条件一致，水泥笼位，饮水器自由饮水，定量饲喂，饲料为安徽新康饲料有限公司成熟商品全价颗粒料。
于春季（5 月）、夏季（8 月初热应激初期、8 月中旬热应激盛期）和秋季（11 月）共3 个季节4 个时间点，各选择8 只试验长毛兔（公母各半），真空采血管采集试验兔耳缘静脉血液5 mL，4℃冷藏过夜，然后用1 mL 规格移液枪小心吸取上层血清分装到1.5 mL 灭菌离心管，于-80℃超低温冰箱保存备用。
1.2 方法
1.2.1 生化指标测定
选择了8 个血液生化指标，其测定方法如下：碱性磷酸酶（ALP）采用NPP 底物-AMP 缓冲液法；
乳酸脱氢酶（LDH）采用乳酸底物法；
肌酸激酶（CK）采用磷酸肌酸底物法；
尿素（UREA）采用尿素酶-谷氨酸脱氢酶法；
丙氨酸氨基转移酶（ALT）采用丙氨酸底物法；
天门冬氨酸氨基转移酶（AST）采用天门冬氨酸底物法；
总蛋白（TP）采用双缩脲法；
白蛋白（ALB）采用溴甲酚绿法。所有指标测定使用Chemray 800型全自动生化分析仪（雷杜，深圳），具体测定方法按雷杜生命科学股份有限公司相应指标的试剂盒说明进行。
1.2.2 统计方法
用WPS 表格对测定的试验数据进行整理，每个性别不同季节间血清水平差异用SPSS 19.0 进行单因素方差分析，多重比较采用Duncan 法；
相同季节不同性别间血清水平差异用非配对t检验进行分析；
均以P＜0.05 作为差异显著水平，所有结果用平均数±标准差表示。
2.1 不同季节长毛兔的酶类指标分析
长毛兔酶类指标血清水平检测结果如表1。对于公兔的ALP 水平，春季最高，且显著高于夏季（P＜0.05），而与秋季无明显差异（P＞0.05），8月初稍低于秋季（P＞0.05），而稍高于8月中旬（P＞0.05）；
对于母兔的ALP水平，秋季最高，且显著高于其他两个季节（P＜0.05），春季次之，但与夏季8月初无显著差异（P＞0.05），而夏季8月中旬时最低，也与8月初差异不明显（P＞0.05）；
就性别而言，母兔秋季的ALP水平显著高于公兔（P＜0.05），而且其他季节公、母兔间差异均不明显（P＞0.05）。对于公兔的CK 水平，8 月初显著高于春季（P＜0.05）和8月中旬（P＜0.05），稍高于秋季（P＞0.05），8 月中旬最低，但与春秋两季无明显差异（P＞0.05）；
母兔CK 水平不存在季节性差异（P＞0.05）；
同一季节公、母兔间CK水平均差异不显著（P＞0.05）。对于公兔的LDH 水平，春季最低，且与秋季差异不明显（P＞0.05），8月初相对春季有较大程度的上升，但差异不显著（P＞0.05），8月中旬显著高于春、秋两季（P＜0.05）；
母兔LDH 水平春季最低，8月初升高，且显著高于春季（P＜0.05），但8月中旬明显下降，秋季与8 月中旬相近，且两者均与春季差异不显著（P＞0.05）；
同一季节公、母兔之间比较，除8 月初母兔LDH 水平显著高于公兔（P＜0.05）外，其他季节公兔均高于母兔，其中8月中旬公、母兔的LDH水平差异显著（P＜0.05）。
表1 不同季节长毛兔的酶类指标血清水平比较
2.2 不同季节长毛兔的血清蛋白及含氮代谢物分析
长毛兔血清蛋白及含氮代谢物水平如表2。对于公兔的TP 水平，春季与8 月初相近（P＞0.05），8 月中旬和秋季均显著高于前两者（P＜0.05），秋季稍低于8月中旬，但差异不显著（P＞0.05）；
对于母兔的TP 水平，8 月初最低，8 月中旬最高，春秋两季居中，但均差异不显著（P＞0.05）；
同一季节公、母兔间的TP 水平差异均不显著（P＞0.05），春季和8 月初母兔稍高，8月中旬和秋季公兔稍高。对于公兔的ALB 水平，8 月初相对春季有一定的下降，8 月中旬升高，与春季接近，秋季均显著高于其他季节（P＜0.05）；
母兔的ALB水平季节变化与公兔类似，相对春季，8 月初有所下降，8 月中旬则显著上升（P＜0.05），秋季最高，且与春季和8 月初间均差异显著（P＜0.05）；
公、母兔间同一季节的ALB 水平均无显著差异（P＞0.05）。对于公兔的UREA 水平，相比春季，8 月初几乎无变化，8 月中旬则大幅下降，秋季有所回升而居中，但各季节间均无显著差异（P＞0.05）；
母兔的UREA 变化规律相异，8月初比春季稍高（P＞0.05），8 月中旬最高，秋季最低，且显著低于夏季两个时期（P＜0.05）；
公、母兔间春季和8 月初均无显著差异（P＞0.05），8 月中旬母兔显著高于公兔（P＜0.05），秋季母兔则较大程度地低于公兔（P＞0.05）。
表2 不同季节长毛兔的血清蛋白及含氮代谢物水平
2.3 不同季节长毛兔的肝功能相关血清指标水平分析
长毛兔肝功能相关血清指标水平如表3。对于公兔的ALT 水平，8 月初有所提高，而8 月中旬则大幅下降，且低于春季（P＞0.05）和8 月初（P＞0.05），秋季继续下降到最低水平，各季节均无明显差异（P＞0.05）；
母兔8月初相对春季大幅下降，8月中旬下降至最低，且显著低于春季（P＜0.05），秋季提高水平仅低于春季；
春季公母兔间的ALT水平相近（P＞0.05），夏季两时期母兔均较大程度地低于公兔，且8月初公母间差异显著（P＜0.05），秋季公兔稍高于母兔（P＞0.05）。对于公兔的AST水平，8月初稍高于春季，8月中旬最高，秋季低于8中旬而高于春季和8 月初，但各季节间均差异不显著（P＞0.05）；
母兔的AST 水平，8 月初最高，8 月中旬最低，且两者差异显著（P＜0.05），秋季稍高于春季，但差异不显著（P＞0.05）；
公、母兔间比较，母兔在春季、8月中旬和秋季的AST水平均低于公兔，但仅与8月中旬差异显著（P＜0.05）。对于公兔的AST/ALT，8 月中旬显著高于春季（P＜0.05），其他各季节无显著差异（P＞0.05）；
母兔的AST/ALT 水平先显著上升（P＜0.05），而后下降（P＞0.05），秋季相对8 月中旬变化很小（P＞0.05）；
春季公母兔间AST/ALT差异很小（P＞0.05），8月初母兔显著高于公兔（P＜0.05），8 月中旬母兔稍低于公兔（P＞0.05），秋季母兔稍高于公兔（P＞0.05）。
表3 不同季节长毛兔的肝功能相关血清指标水平
研究表明，ALP广泛分布于骨骼、肝、肾等组织，主要反映肝脏功能和骨组织生长代谢状况［13］。不同生产类型、不同品种的家兔血清ALP水平有明显差异［14-15］，而且血清ALP 水平高低与肉兔100 日龄体重和日增重［16］以及皖系长毛兔1 岁成年剪毛量呈显著相关［17］。本研究中公兔和母兔的血清ALP水平均随着夏季应激持续而大幅下降，而秋季则显著上升，说明ALP受季节影响且对热应激敏感，秋季气温适宜，ALP水平升高恢复正常，此结果与周明亮等［18］对白藏羊的研究结果一致。黄冬维等［19］研究发现，长毛兔血清ALP 水平受采毛应激影响而显著下降，且48 h 内不能恢复。而从本研究推测，ALP 也是热应激的潜在血清指标。CK 主要反映骨骼肌和心肌功能。本研究中公、母兔的血清CK水平变化规律一致，其中公兔变化显著，8 月初大幅上升。孙宏涛等［20］研究发现，急性热休克可导致新西兰白兔心肌匀浆上清CK 升高［20］。而持续热应激时牛血清CK 大幅下降到春季水平，秋季又大幅上升，呈波浪式变化，可能刚应激时肌肉代谢增加，而后持续应激造成不应性［21-23］。高温夏季生猪血清CK 显著高于秋冬两季［24］。本研究中兔秋季CK 大幅上升的原因需要进一步研究［25］。LDH 广泛分布于细胞和体液中，临床上主要用于心肌、肝脏和肿瘤疾病的诊断［26］。兔出血症病在高热期和濒死期，其血清LDH 水平显著升高［27］。本试验公兔的LDH 随热应激时间持续逐渐升高，应激盛期时显著高于其他3 个时期；
而母兔刚热应激时，相对其他3 个时期显著升高，而持续应激时却基本恢复正常，稍高于春季，与秋季相近，但此三者无显著差异，可能母兔的抗应激能力较强并未发生免疫抑制［28］
血清TP 和ALB 含量反映了动物体对蛋白质消化吸收和合成代谢的状况［29］。本研究中长毛兔公兔的总蛋白在应激盛期和秋季均显著高于春季和应激之初，而母兔各季节变化不显著；
公兔的白蛋白春季居中，夏季应激之初、盛夏应激和秋季逐渐显著升高，母兔的白蛋白水平和变化趋势与公兔相似，可见白蛋白是长毛兔热应激早期的反映指标，而应激持续对其无影响。周明亮等［18］研究表明，白藏羊夏季和秋季的血清总蛋白显著高于春季，白蛋白随春—夏—秋季节变化逐渐上升，秋季显著高于春季，与本研究结果一致。周明亮等［30］研究表明，藏绵羊的血清总蛋白和白蛋白水平均为夏季和秋季高于春季，与本研究总蛋白结果相似，而与白蛋白结果不一致，可能原因是本研究设计了热应激初期这一时间，也因此揭示了白蛋白随应激时间长短所表现的变化规律。血清UREA 是动物体蛋白氮代谢的主要终产物，反映了机体蛋白代谢水平和肝肾功能。本研究公、母兔的UREA 均为春季高、秋季低，夏季公兔的UREA 水平变化不显著，而母兔则持续升高且均显著高于秋季，推断母兔肾脏功能可能受到热应激的影响，同时也有可能与夏季饲料采食量下降有关［31］。当然也有研究表明，尿素氮与冷应激［21］和饲料蛋白含量［32］有关，因本研究不涉及故不作讨论。
ALT和AST是反映肝脏功能的重要指标［33］。本研究中公兔不同季节的ALT 和AST 水平有一定变化，但差异不显著；
夏季母兔的ALT 水平低于春、秋两个季节，特别是热应激盛期显著低于春季，与刘亚娟等［34］报道一致。从春季到8 月初，母兔的AST 水平稍有升高，这与对新西兰白兔的研究结果相似［35］，夏季热应激盛期相对8 月初显著下降，而春、秋两季水平接近。顾剑［4］的研究结果表明，高温环境下长毛兔的血清AST和ALT 水平均显著高于常温条件的长毛兔，并且其产毛量显著减少。AST/ALT 比值是肝脏功能的重要衡量指标，比值异常说明肝脏可能受到了损伤［36］。本研究中公兔在应激盛期显著高于春季，且同样高于应激初和秋季，说明公兔受到了持续应激的显著影响，母兔在应激之初即较大幅度上升，到应激盛期反倒大幅降低到春秋两季水平，说明母兔可能对应激反应敏感，但其热应激耐受力强，抗应激性更好。
本文研究了长毛兔的酶类、蛋白及代谢物血清水平的季节性差异，筛选到主要变化指标有ALP、ALB、LDH、AST/ALT 比值等，前两者因应激下降，特别是ALP变化显著或幅度较大，而后两者受应激而升高，其中LDH 变化显著。其他指标也有部分不同程度的变化。从性别反应来看，公兔的应激反应相对较小或较慢（LDH、AST/ALT 比值），但是影响持久；
母兔的应激反应敏感（LDH、AST/ALT 比值）但恢复较快，可能抗应激能力稍强于公兔。因此，在生产实际如繁殖管理过程中，夏季要特别关注公兔的应激，同时注意做好春夏应激前预防和夏季应激处理，以便减少损失，同时顺利开展秋繁工作。