陈 龙，郑详武（.通用环球西安北环医院检验科，西安 7003；
.山阳县人民医院检验科，陕西商洛 76400）
人绒毛膜促性腺激素β 亚基（β-human chorionic gonadotropin，β-hCG）和孕酮（Progesterone，Prog）是育龄期女性最常用的检测项目，目前主要采用的方法之一是基于生物素-链霉亲和素（biotin-avidin-streptavidin，BAS）的化学发光技术[1]，但生物素会对该技术产生干扰，导致检测结果假性升高或假性降低[2-5]。妊娠期女性对生物素的需求量较未妊娠期高[6-7]，因此妊娠期女性在采用该技术检测β-hCG 和Prog 时，受到生物素干扰的风险更高。然而目前人们对此关注较少，基层实验室也缺少对此的应对方法。有研究报道，采用高浓度链霉亲和素磁珠（streptavidin coated magnetic micro particles，M）可增强抗生物素干扰能力[8]，本文据此试图建立一种针对β-hCG 和Prog 的简易的抗生物素干扰方法，以减少临床误诊和漏诊的风险。
1.1 研究对象 采用两种浓度的M（M1 和M2）检测添加了不同浓度生物素的高、中、低水平的β-hCG 和Prog 样品。血清样品来自于2022年5月1日～9月30日通用环球西安北环医院检验科日常检测后的标本制成的混合血清。
1.2 仪器与试剂 电子分析天平（0.1 mg）（德国赛多利斯集团）；
低速离心机（长沙湘智公司）；
罗氏E 601全自动电化学发光免疫分析系统，β-hCG自动电化试剂（批号45406003），Prog 试剂（批号47811003）均为瑞士罗氏公司产品；
M 试剂以罗氏β-hCG 和Prog 试剂盒中的M 试剂为原料进行制备，生物素试剂（99.9%纯度，Sigma 公司，批号SLBS8478），PBS 溶液（上海如吉生物科技发展有限公司，批号1906ZPW02）。
1.3 实验方法
1.3.1 生物素溶液制备：精确称量10 mg 生物素，溶于50 ml PBS 溶液中。其生物素浓度为200 000 ng/ml。用PBS 稀释制备浓度为250，500，1 000，2 000，3 000，4 000，5 000，6 000，7 000，8 000，9 000和10 000 ng/ml 的生物素溶液。另取2 ml PBS 溶液作为生物素浓度为0 ng/ml。4～8℃冰箱保存备用。
1.3.2 混合血清制备：冻存于-80℃的β-hCG 和Prog 高、中、低值血清各10 份（β-hCG 和Prog原始浓度范围分别为10.3～ 9 855 IU/L 和5.85～180.6 nmol/L）。每份血清各取280 µl，充分混匀，共2 800 µl；
分为15 份，每份180 µl，分别标识为“β-hCG/Prog 高/中/低值混合血清”。制成的混合血清其高、中、低值浓度分别为：β-hCG：9 721，2 605 和128 IU/L；
Prog：138.0，57.5 和13.1 nmol/L。-80℃冰箱保存备用。
1.3.3 生物素血清制备：取13 份β-hCG 高值混合血清，第一份不添加任何物质，从第二份开始分别加入浓度为0，250，500，1 000，2 000，3 000，4 000，5 000，6 000，7 000，8 000，9 000 和10 000 ng/ml 的生物素溶液20 μl，血清中的生物素浓度分别为0，25，50，100，200，300，400，500，600，700，800，900 和1 000 ng/ml。剩余2 份血清留存备用。按上述方法分别制备β-hCG 中、低值和Prog 高、中、低值生物素血清。
1.3.4 高浓度 M(M2)制备：已知罗氏公司生产的M 试剂链霉亲和素磁珠浓度为0.72 mg/ml，以此为低浓度M（M1）；
并以此为原材料，取出12 ml 装于试管中，1 000 r/min 离心15 min，吸取上清液6 ml 弃去，剩余的6 ml 即为1.44 mg/ml 的M(M2)。标识清楚，4～8℃冰箱保存备用。
1.3.5 实验方法：在罗氏E 601 检测平台上，分别采用两种M 检测血清样品的β-hCG 和Prog 浓度。通过回收试验评价两种M 的抗生物素干扰能力以及M2 检测β-hCG 和Prog 的准确度[9]。
1.4 统计学分析 采用Excel 2013 进行统计分析。回收率计算方法：①抗干扰能力阈值的回收试验：回收率（%）=（各M 有生物素添加时的检测结果/各M 无生物素添加时的检测结果）×100%；
②M2 检测准确度的回收试验：回收率（%）=（M2有生物素添加时的检测结果/M1 无生物素添加时的检测结果）×100%。回收率在90%～110%之间为可接受标准。
2.1 两种浓度M 时β-hCG 和Prog 的抗生物素干扰能力 随着样品中生物素浓度的增加，β-hCG三个水平的检测结果均逐渐下降；
而Prog 三个水平的检测结果均逐渐升高。与无生物素添加的样品相比，M1 时β-hCG 和Prog 三个水平的回收率均在90%～110%之间时所对应的生物素浓度分别为100 和25 ng/ml 以下。见表1。而M2 时β-hCG 和Prog 三个水平的回收率均在90%～110%之间时所对应的生物素浓度分别为500ng/ml 和50 ng/ml 以下。见表2。
表1 低浓度链霉亲和素磁珠（M1）时β-hCG 和Prog 的回收试验
表2 高浓度链霉亲和素磁珠（M2）时β-hCG 和Prog 的回收试验
2.2 M2 检测β-hCG 和Prog 的准确度评价 根据表1 和表2，在应用M1 校准曲线时，以M1 检测无生物素添加的结果为基准，M2 检测生物素浓度在500 ng/ml 以下的β-hCG，三个水平的回收率均在90%～110%之间；
M2 检测生物素浓度在50 ng/ml以下的Prog，高、中水平的回收率在90%～110%之间，而低水平的回收率为114.75%。
见表3。
表3 应用M1 校准曲线时M2 检测β-hCG 和Prog 的回收率（%）
生物素(biotin)，又称为维生素H、维生素B7、辅酶R 等，是水溶性维生素B 族成员之一[10-11]，具有多种生物学作用，是多种羧化酶的辅酶，也是合成维生素C 的必要物质，在脂肪合成、糖质新生等生化反应途径中扮演重要角色[12]。尽管目前认为高剂量生物素对人体无毒害作用，一般膳食摄入量也不足以影响基于BAS 的化学发光项目测定，但是长期大剂量摄入生物素的情况还是会导致在应用该技术时受到干扰的风险增加。文献报道，美国人群生物素的日常摄入参考量为30 µg/天[13]，但从1986年以来，美国人群中服用含有生物素补充剂的比例从17%上升至33%，剂量通常在100 µg 左右，最高可达10 000 µg，这导致了近些年来生物素干扰案例增多[14-16]。根据《中华人民共和国卫生行业标准WS/T 578.5-2018》[6]，妊娠女性推荐的生物素适宜摄入量为50 mg/天，这更是远高于美国人群的摄入量。因此，中国妊娠女性在应用基于BAS 的化学发光检测β-hCG 和Prog 时，受到生物素干扰的风险可能更高，广大基层实验室对这两个项目亟需一种简易有效的抗干扰方法。
本研究根据生物素对基于BAS 化学发光技术干扰的机制[17-20]而设计。该机制提示：干扰的发生是由于外源性生物素会和试剂中的生物素竞争性地与链霉亲和素结合，发光物质不能被链接于磁珠上的链霉亲和素捕获，导致可被检测到的光信号下降[19]。由于夹心法模式中待测物浓度与光信号呈正相关，故表现为检测结果的假性降低；
而竞争法模式中待测物浓度与光信号呈负相关，故表现为检测结果假性升高[20]。因此，当链霉亲和素足够多时，即可保证所有的发光物质被捕获，从而避免干扰。而链霉亲和素通常是和磁珠链接在一起的，因此增加反应体系中M 的量可提升抗生物素干扰能力。多位学者[21-22]已在仪器内外通过预先使用M 试剂对样品中的生物素进行吸附去除，取得了一定的效果。但也有研究发现，M 浓度过大可对光信号产生一定的屏蔽作用，M 浓度越大，屏蔽作用越强。当M 浓度超过1.44 mg/ml 时，如果要用于项目检测，则需要建立新的校准曲线，且其空白检出限、最低检出限和定量检出限均会受到一定的影响[8,23]。因此，本研究中采用了光信号在达到平台期时的最大M 浓度1.44 mg/ml（M2）[24]。
β-hCG 为夹心法模式而Prog 为竞争法模式，因此随着生物素干扰的增多，β-hCG 检测结果下降，而Prog检测结果升高。本研究显示，对于β-hCG和Prog，M1 的抗生物素干扰能力分别为100 和25 ng/ml（表1），这与罗氏公司试剂说明书中所声明的干扰阈值大致接近；
而M2 的抗生物素干扰能力分别可达到500 和50 ng/ml（表2），这要远高于M1 的抗干扰阈值。在应用M1 校准曲线时，M2 在其抗干扰阈值以下时，对于高、中、低水平的β-hCG和高、中水平的Prog 均具有较好的准确度（表3）。尽管对于低水平Prog，在50 ng/ml 的生物素干扰时，其回收率为114.75%，略高于既定的标准，但绝对值差异只有1.8 nmol/L（表1，表2）。对于低水平样品，通常宜采用更宽的接受标准或采用绝对值差异来表述，血糖仪的比对合格标准即是如此[25]。因此，1.8 nmol/L 的差异也是可以接受的。基于以上，可以认为在应用M1 校准曲线时，M2 可增加β-hCG和Prog的抗生物素干扰能力，且具有较好的准确度。需要注意的是，由于条件限制，本研究未能对血清中真实生物素浓度进行测定，生物素干扰阈值只是根据所加入的生物素量来计算，这可能导致本文中的生物素干扰阈值偏低。另外，本研究也未对M2的检出限进行评价，这可能对低值样品有一定影响。
综上所述，对于妊娠人群，在应用基于BAS化学发光技术检测β-hCG 和Prog 时，采用M2 可以增强其抗生物素干扰能力，不需要建立新的校准曲线，可保证一定的准确度，从而降低生物素干扰带来的误诊和漏诊的风险。另外，相较于文献中已报道的其他方法会增加30～120 min 的周转时间（TAT）[22,26]，本方案几乎不会延长TAT。对于终端用户来讲，每个试剂盒均有一定的剩余量，可以用来制备少量的M2，也不会增加实验室的成本负担。因此，本方案是一种经济、便捷、有效且较为可靠的抗生物素干扰方法，适合于基层实验室日常工作中应急使用。
猜你喜欢 生物素低值磁珠 显微镜手工计数法在低值血小板计数中的应用中国典型病例大全(2022年11期)2022-05-13生物素在养猪生产中的应用兽医导刊(2020年23期)2020-12-30磁珠固定化凝血酶的制备及其在槐米中活性化合物筛选中的应用天然产物研究与开发(2018年10期)2018-11-06防治脱发的生物素农村青少年科学探究(2017年6期)2017-09-11鸢尾黄斑病毒免疫磁珠RT-PCR检测方法的建立及应用上海农业学报(2016年5期)2016-02-10新型生物素标记的苦杏仁苷活性探针的合成合成化学(2015年4期)2016-01-17生物素的营养功能及其在奶牛饲养中的应用饲料工业(2016年23期)2016-01-09强碱三元复合驱含水低值期动态调整技术研究大庆师范学院学报(2015年3期)2015-12-24可选择型低值电容标准的研究电测与仪表(2015年12期)2015-04-09应用磁珠法检测并提取尿液游离甲基化DNA中国医科大学学报(2015年10期)2015-03-01