何飞燕,陈 欢,邱志霞,金子恒,齐淑贞,黄 芳
(1.中国药科大学中药学院,江苏 南京 211198;2.河南中大恒源生物科技股份有限公司,河南 漯河 462600;3.中国医学科学院皮肤病研究所,江苏 南京 210042)
动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是以脂质代谢障碍为基础的血管疾病,病变常累及大、中动脉,同时伴有平滑肌细胞和纤维基质增生[1]。AS是目前引起心血管疾病的主要原因之一[2]。炎症在AS发生发展的各个阶段都具有重要作用,因此AS通常也被认为是一种慢性炎症性疾病[3]。内皮细胞是维持血管内稳态和低氧化应激的重要调节器。其可以通过分泌各种因子响应物理化学信号,进而调节血管张力、细胞黏附、血栓生成、平滑肌细胞增殖和血管壁炎症等[4]。持续的炎症刺激可以诱导内皮细胞持续激活,发生内皮细胞功能障碍,在AS等心血管疾病的进程中发挥重要作用[5]。
姜黄素(Curcumin)是从姜黄属(CurcumaL.)中药材中提取获得的多酚类活性成分。研究[6-8]证实其具有抗炎、抗氧化、免疫调节等多种作用,表现出很强的内在活性。然而,传统姜黄素水溶性低,肠道吸收相对较差,体内代谢途径广泛,经胆囊排泄迅速,口服的系统生物利用度较低[9-10],严重影响姜黄素的临床应用。
1.1 实验动物 12只清洁级SD大鼠,6～8周龄,体质量180～220 g,雌雄各半,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。生产许可证号为SCXK(湘)2019-0004,实验动物质量合格证号为430727200101169841。动物饲养于西南大学药学院实验动物中心,相对湿度50%～70%,室温23～25 ℃,自然昼夜光线照明。
1.2 细胞株 HUVECs:江苏凯基生物技术股份有限公司。
1.4 仪器 多功能荧光酶标仪:美国Thermo Fisher Scientific公司;化学发光成像仪:上海天能科技有限公司;实时荧光定量PCR仪:美国Bio-Rad公司;液质联用系统UPLC(I-Class)-MS(XEXO TQD):美国Waters公司;AB 135-S天平:梅特勒·托利多仪器有限公司。
2.2.1 标准溶液的配制 对照品溶液的配制:精密称取姜黄素对照品1.09 mg,甲醇定容至10 mL,得浓度为10.9 μg/mL的贮备液。内标溶液的配制:精密称取盐酸小檗碱对照品1.60 mg,甲醇定容至10 mL,得浓度为160 μg/mL的贮备液,再用甲醇稀释,配制浓度为960 ng/mL的内标对照品溶液。
2.2.2 样品的预处理方法 取空白血浆100 μL,加入盐酸小檗碱内标溶液10 μL,混匀,加乙酸乙酯0.3 mL,涡旋混合2 min,4 000 r/min离心10 min,分离上清液;下层沉淀重复上述操作,合并2次的上清液,40 ℃真空干燥。残渣加100 μL甲醇复溶,涡旋混匀2 min,经0.22 μm微孔滤膜过滤,待测。
2.2.3 UPLC-MS/MS分析条件 色谱条件:Waters ACQUITY UPLC BEH(2.1 mm×50 mm,1.8 μm)色谱柱;流动相为0.1%甲酸水溶液(A相)及0.1%甲酸乙腈溶液(B相),流速0.4 mL/min;柱温35 ℃;进样量1 μL。梯度洗脱(0～0.5 min,95% A;0.5～1.5 min,95%～2% A;1.5～3.5 min,2% A;3.5～4 min,2%～95% A,4～6 min,95%A)。质谱条件:ESI离子源;正离子模式;离子源温度400 ℃;脱气流速700 L/h;锥孔体积流量流速50 L/h;毛细管电压3.0 kV。
2.3 HUVECs培养 HUVECs采用含10%血清的RPMI-1640培养基培养,于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育。倒置显微镜观察,细胞生长至约80%时传代。
2.5 TNF-α诱导HUVECs炎症模型 HUVECs炎症模型的建立参照文献[11-12]。将生长良好的HUVECs接种于96孔板中,细胞贴壁后弃去培养液,加入含TNF-α(30 ng/mL)的无血清培养基培养24 h,诱导HUVECs炎症模型。
2.8 实时定量PCR检测关键炎症因子环氧合酶-2(cyclooxygense-2,COX-2)、MCP-1 mRNA表达水平 HUVECs给药及模型复制方法同“2.6”项。模型复制24 h后收集细胞以提取RNA。以20 μL逆转录反应体系进行逆转录后进行实时荧光定量PCR。反应条件:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性10 s;55～60 ℃退火20 s;72 ℃延伸20 s。引物序列见表1。实验平行重复3次。
表1 目标基因的引物序列
2.9 Western blot法检测NF-κB通路关键蛋白的表达水平 将生长良好的HUVECs以每孔2×105个接种于6孔板,按照“2.6”项的分组对细胞进行给药预保护及TNF-α作用24 h,模型复制完成后于冰上提取蛋白。BCA试剂盒进行蛋白定量,SDS-PAGE进行电泳分离并电转到PVDF膜,5% BSA封闭1 h,4 ℃孵育p65、p-p65、IκB、p-IκB一抗过夜,次日于室温孵育对应二抗1 h,洗膜后加入ECL发光液显影成像。实验重复3次。
图1 两种姜黄素制剂在大鼠体内的血药
表2 两种姜黄素制剂在大鼠体内的主要药物动力学参数比较
注:与0 μmol/L比较,#P<0.05
3.3 相同给药时间、不同给药浓度两种姜黄素制剂的抗炎作用比较
3.3.1 8组HUVECs内NO水平比较 与空白组比较,模型组NO水平显著升高(P<0.05);与模型组比较,各浓度姜黄素组NO水平显著降低(P<0.05)。结果表明,姜黄素干预可显著降低TNF-α诱导的细胞内NO水平,减轻内皮细胞损伤。见图3。
注:A.空白组;B.模型组;C.0.5 μmol/L PURCUMIN组;D.1 μmol/L PURCUMIN组;E.5 μmol/L PURCUMIN组;F.10 μmol/L PURCUMIN组;G.5 μmol/L Curcumin 95%组;H.10 μmol/L Curcumin 95%组;与空白组比较,#P<0.05;与模型组比较,*P<0.05
注:A.空白组;B.模型组;C.0.5 μmol/L PURCUMIN组;D.1 μmol/L PURCUMIN组;E.5 μmol/L PURCUMIN组;F.10 μmol/L PURCUMIN组;G.5 μmol/L Curcumin 95%组;H.10 μmol/L Curcumin 95%组;与空白组比较,#P<0.05;与模型组比较,*P<0.05
注:A.空白组;B.模型组;C.0.5 μmol/L PURCUMIN组;D.1 μmol/L PURCUMIN组;E.5 μmol/L PURCUMIN组;F.10 μmol/L PURCUMIN组;G.5 μmol/L Curcumin 95%组;H.10 μmol/L Curcumin 95%组;与空白组比较,#P<0.05;与模型组比较,*P<0.05
注:A.空白组;B.模型组;C.0.5 μmol/L PURCUMIN组;D.1 μmol/L PURCUMIN组;E.5 μmol/L PURCUMIN组;F.10 μmol/L PURCUMIN组;G.5 μmol/L Curcumin 95%组;H.10 μmol/L Curcumin 95%组;与空白组比较,#P<0.05;与模型组比较,*P<0.05
3.4 相同给药浓度、不同给药时间两种姜黄素制剂的抗炎作用比较
注:A.空白组;B.模型组;C.10 μmol/L PURCUMIN组;D.10 μmol/L Curcumin 95%组;与空白组比较,#P<0.05;与模型组比较,*P<0.05
注:A.空白组;B.模型组;C.10 μmol/L PURCUMIN组;D.10 μmol/L Curcumin 95%组;与空白组比较,#P<0.05;与模型组比较,*P<0.05
值得注意的是,在相同给药时间、不同给药浓度的抗炎作用实验中,两种姜黄素制剂的浓度设计并不完全对应,这一方面是由于在摸索给药浓度的预实验中,低浓度(0.5、1 μmol/L)的Curcumin 95%抗炎作用的差异无统计学意义;另一方面,从正式实验的定量结果中可以看到,Curcumin 95%(5 μmol/L)给药后除显著降低IL-6水平之外,对其他炎症因子及关键炎症基因的抑制作用并不显著,对NF-κB通路中关键蛋白表达也不存在显著的调节作用,即5 μmol/L Curcumin 95%体外抗炎作用仍然较差。基于上述背景,笔者认为没有必要设置低浓度(0.5、1 μmol/L)的Curcumin 95%组别,并在最终的实验中取消了这两个组别。
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