惠美星,宋 虹,余 萍,闵祥博,矫艳平,赵 迪
(1. 江西仁仁健康微生态科技有限公司,江西 樟树 331200;2. 渤海大学 食品科学与工程学院,辽宁 锦州 121013)
酵素是一种由酵母、乳酸菌和霉菌等多菌种发酵果蔬、菌菇和中草药等原料而成的功能产品,因含有大量的生物活性物质(如维生素、矿物质、多糖、多酚、氨基酸、酶及一些次生代谢产物等),在食品、医药以及环境等领域应用相当广泛[1-2]。据报道,全球酵素消费市场达27.4亿美元,主要集中在美国和欧洲地区,而且酵素的发展空间和增长潜力非常大,预计年增长率在7%以上[3]。
酵素具有广泛的生物学活性。Ahn等[4]发现,酵素在非细胞系统中对1,1-二苯基-2-苦酰基肼自由基(DPPH·)、羟基自由基(·OH)和H2O2自由基具有清除活性,并具有较高的螯合能力和还原能力;在细胞系统中,它表现出显著的活性氧清除能力,抑制脂质过氧化,并诱导谷胱甘肽水平升高。Ahrén等[5]研究发现,植物乳杆菌DSM 15313发酵的蓝莓粉具有显著的降压作用,可降低大鼠心血管疾病风险。Nam等[6]发现,摄入大豆酵素提取物能显著降低空腹血糖和糖化血红蛋白水平,同时保持较高的胰岛素水平,这与Lim等[7]的研究一致,表明大豆酵素提取物在非胰岛素依赖性糖尿病小鼠模型中具有抗糖尿病作用。Takagi等[8]发现,发酵的豆奶有降低乳腺癌风险的潜力。Abd Razak等[9]发现,以黑曲霉和少孢霉发酵碎米可能产生具有显著抗氧化活性的成分,该酵素提取物有作为药妆配方中抗衰老和/或抗色素沉着剂的潜力。
玫瑰(RosarugosaThunb)是一种落叶灌木,属于蔷薇科,具有重要的经济和药用价值,在我国许多地区都有栽培。玫瑰中含有维生素C、必需氨基酸(赖氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、缬氨酸和苏氨酸)、脂肪酸、矿物质和其他生物活性物质[10],具有改善皮肤、抗衰老、抗氧化、免疫调节以及驱虫的药理作用[11-12]。然而,随着花的枯萎,大部分的营养物质很容易流失,所以玫瑰常被加工成各种消费品,如食品工业中的果汁、果酱、果醋、酒和蛋糕原料等[13]。桑葚是桑树的果实,含有丰富的维生素、微量元素、氨基酸、多酚及多糖等营养成分。桑葚可以缓解皮肤方面的问题,如减少随着年龄增长出现的斑点和瑕疵,抑制自由基相关的氧化活性,从而使皮肤更健康和有光泽[14]。另外,桑葚具有良好的酪氨酸酶抑制活性,已经成为美白护肤产品的主要成分之一[15]。玫瑰茄富含生物活性物质,如花青素和其他类黄酮、有机酸和多糖,具有抗氧化、抗菌、抗炎、护肝和美白养颜的功效[16]。消费者日益丰富的需求将极大地促进酵素行业产品尽快实现多样化。
本研究主要选择3种具有抗氧化、美白润肤功效且是药食同源的重瓣红玫瑰、桑葚及玫瑰茄为原料,利用植物乳杆菌(HCS03-001)、罗伊氏乳杆菌(HCS02-001)和鼠李糖乳杆菌(HCS01-013)益生菌进行发酵获得玫瑰酵素,测定其理化成分、酶活性及其体外抗氧化活性,并通过人群实验考察玫瑰酵素对肤色(美白)、淡斑、肌肤纹理及肌肤弹性的改善作用,以期科学评价该玫瑰酵素的理化品质和抗氧化能力,并为高附加值玫瑰酵素产品研发及玫瑰酵素功能性评价研究提供理论参考。
1.1 材料与试剂
植物乳植杆菌(LactobacillusplantarumHCS03-001)、罗伊氏粘液乳杆菌(LactobacillusreuteriHCS02-001)、鼠李糖乳酪杆菌(LactobacillusrhamnosusHCS01-013),以上菌株均筛选自健康婴儿肠道或传统发酵食品;重瓣红玫瑰、桑椹、玫瑰茄,市售;低聚果糖、低聚异麦芽糖,保龄宝生物股份有限公司;无水葡萄糖,石药集团圣雪葡萄糖有限责任公司;酵母蛋白胨、酵母浸出物,安琪酵母股份有限公司;L-苹果酸,常茂生物化学工程股份有限公司;一水柠檬酸,潍坊英轩实业有限公司;KH2PO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O,江苏科伦多食品配料有限公司;无水CaCl2,焦作市冠通化工有限公司;DPPH·,上海麦克林生化科技有限公司;羟自由基清除能力测定试剂,北京索莱宝科技有限公司;无水乙醇、邻二氮菲、磷酸盐缓冲液(PBS)、FeSO4·7H2O、乙二胺四乙酸(EDTA)、双氧水(H2O2),国药集团化学试剂有限公司,均为分析纯。
1.2 仪器与设备
DNP- 420型培养箱,北京市永久光明医疗器械有限公司;PHS-25B型酸度计,上海大普仪器有限公司;JH723PC型可见分光光度计,上海菁华科技仪器有限公司;50 L发酵罐,沈阳升顺机械设备有限公司;H1650型医用离心机,长沙湘仪离心机仪器有限公司,Chromameter CR-400型三刺激比色计,日本美能达照相机有限公司;Mexameter MX18型皮肤黑色素和血红素测试仪、SV600型皮肤图像分析系统,德国Courage &Khazaka公司。
1.3 方法
1.3.1 菌种活化
活化培养基(质量分数):无水葡萄糖4.0%、酵母浸出物1.5%、酵母蛋白胨1.0%、L-苹果酸 0.3%、一水柠檬酸 0.2%、KH2PO40.2%、无水CaCl20.05%、MgSO4·7H2O 0.006%、MnSO4·H2O 0.001%。
培养基配制:按照配方比例进行原料处理,配制培养基,pH调至5.0～7.0;115 ℃灭菌30 min后备用。
菌粉添加比例为0.05%(质量分数),使用常温无菌水溶解菌粉,投入培养基中,发酵16～20 h,制得菌液。
1.3.2 酵素的制备
发酵培养基(质量分数):重瓣红玫瑰5%、低聚异麦芽糖5%、桑椹1.5%、玫瑰茄0.5%、低聚果糖1%,加适量水,打浆后分装,每瓶用饮用水补足至100 mL;接种量为5%(体积分数);37 ℃发酵72 h;发酵液在13 000 r/min下进行离心,60～70 ℃浓缩,65 ℃巴氏灭菌30 min,无菌灌装。
1.3.3 理化指标的测定
多酚含量检测主要参照GB/T 31740.2—2015 附录A;前花青素(以前花青素B1计)含量检测参照 GB/T 22244—2008;乳酸含量检测参照GB 5009.157—2016;γ-氨基丁酸(GABA)含量检测参照QB/T 4587—2013;超氧化物歧化酶(SOD)酶活检测参照GB/T 5009.171—2003 第一法;游离氨基酸含量检测参照GB 5009.124—2016。
1.3.4 抗氧化活性测定
取适量样品经过滤及稀释(10倍)后,用于抗氧化活性评定。按照姜峰等[17]的方法,测定不同发酵时间的玫瑰本草酵素发酵液对DPPH·和OH·的清除能力。
1.3.5 纤维素酶活力测定
参照《纤维素酶制剂》(QB 2583―2003)的标准方法进行。
1.3.6 果胶酶活力测定
采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定该酵素发酵过程中果胶酶酶活的变化[18]。
1.3.7 人群试验
样品:玫瑰本草酵素,35 mL,无安慰剂对照。
受试者:随机邀请25周岁至55周岁人群,根据自身皮肤情况填报信息,以自愿原则筛选116名受试者,试验过程中退出12人,最终有效样本共计104人(男8人、女96人,平均年龄36.7岁)参与玫瑰酵素改善肤质人群试验。
试验周期:30 d。
测试方法:①试验组每人每日早晚服用1袋玫瑰本草酵素(35 mL),试验期间不使用任何化妆品;②受试者在连续饮用酵素在30 d后,采用三刺激比色计、皮肤黑色素和血红素测试仪、皮肤色度及皮肤图像分析系统,分别测试受试者面部皮肤色度、黑色素含量、皮肤纹理及弹性变化,受试者0 d面部皮肤情况作为空白对照。
2.1 玫瑰本草酵素基本成分
玫瑰本草酵素基本成分的分析结果见表1。由表 1 可知:玫瑰本草酵素中含有多种活性物质,如多酚、SOD、前花青素、乳酸、GABA、游离氨基酸,其中多酚含量、SOD酶活及前花青素含量分别为38 mg/g、33.2 U/mL和244 mg/kg,这与该酵素具有抗氧化能力密切相关[19-21]。玫瑰本草酵素作为一种功能性产品,通过乳酸菌发酵可更好地赋予其显著的乳酸风味[22],其乳酸含量为5.5×103mg/kg,满足现代消费者对健康的追求。特别是该酵素发酵过程中产生了GABA,含量为562 mg/kg。GABA作为营养补充剂及智力辅助剂被应用于功能食品,引起了广泛的关注[23]。GABA主要由微生物细胞内谷氨酸脱羧酶(GAD)催化L-谷氨酸或其盐类而进行生物合成。乳酸菌通常被认为是最安全有效的产GABA菌株[24],乳酸菌发酵会降低发酵系统的pH,更能提高GAD活性。在本研究中,乳酸菌发酵使酵素的pH有效降低,为提高GABA的产量提供了有利条件。另外GABA具有缓解焦虑、降血压、改善睡眠、祛皱和美白的功效;在祛皱时,GABA可放松紧绷的肌肉神经组织,快速穿透皮肤,淡化细纹,增强肌肉本身的放松机能,起到快速祛皱功效[25]。此外,此酵素产品中游离氨基酸含量为0.68 mg/g,它对于细胞分裂、伤口复原和分泌激素等方面均起着重要的作用,而且能够提高机体免疫力并促进肌肉合成[26]。
表1 玫瑰本草酵素主要成分测定
2.2 玫瑰本草酵素发酵液对DPPH·清除率的影响
DPPH·常用于体外抗氧化活性的评价[27]。因此,考察不同发酵时间的玫瑰本草酵素对DPPH·的清除能力,结果如图1所示。由图1可知:与未发酵样品相比,发酵样品清除DPPH·能力均显著提高(P<0.05)。同时,该样品清除DPPH·的能力随着发酵时间的延长而增加。植物经乳酸菌发酵后,其抗氧化能力会显著提高,抗氧化能力的增加与SOD酶活提升、多酚和前花青素类物质的转化与代谢有关[2,19-20]。与未发酵底物相比,玫瑰本草酵素对DPPH·的清除能力提高了0.43倍(从61.80%提高到88.71%)。当发酵时间从40 h延长到50 h时,酵素抗氧化性趋于平衡,这是因为前期乳酸菌代谢旺盛,繁殖迅速,随着发酵时间的延长,各营养物质迅速被代谢,生长pH发生变化,导致其发酵能力逐渐下降,在发酵后期DPPH·清除能力增加缓慢[28]。
图1 玫瑰本草酵素发酵时间对DPPH·的清除能力Fig.1 Effects of rose enzyme fermentation time on DPPH radicals scavenging
2.3 玫瑰本草酵素发酵液对·OH清除率的影响
不同发酵时间的玫瑰本草酵素对·OH的清除能力如图2所示。由图2可知:与DPPH·清除效果相似,在考察条件下的发酵样品对DPPH·的清除能力与未发酵样品相比均显著提高(P<0.05)。与未发酵底物相比,发酵50 h时,玫瑰本草酵素对·OH的清除能力提高了1.09倍(从20.72%提高到43.37%)。这可能是因为发酵引起底物的结构破坏,导致各种抗氧化化合物的释放或合成[17,9]。
图2 玫瑰本草酵素发酵时间对·OH的清除能力Fig.2 Effects of rose enzyme fermentation time on hydroxyl radicals scavenging
2.4 玫瑰本草酵素发酵过程中SOD酶活的变化
SOD酶是细胞防御系统中的一种主要抗氧化酶,存在于动物、植物和微生物中,是国际公认的细胞防御系统的主要抗氧化酶,具有延缓机体衰老、预防肿瘤生长及预防免疫系统性疾病等作用[29]。玫瑰本草酵素发酵过程中SOD酶活的变化如图3所示。由图 3 可知:在玫瑰花本草酵素发酵最初,SOD酶活为(6.12±2.16) U/mL,随着时间延长,SOD酶活逐渐增强;在50 h时SOD酶活最高,为(41.55±3.21) U/mL,较起始提升了5.79倍,且具有显著性差异(P<0.05),这与夏国灯等[27]研究结果类似。这可能因为在发酵过程中,微生物不断繁殖,SOD酶得到了有效积累。此外,发酵后期(30～50 h),SOD酶活增长缓慢。王瑜等[30]研究发现,SOD 酶活不稳定且容易衰退,另外发酵后期微生物代谢速率有所下降,最终导致SOD酶活增长缓慢。
图3 发酵过程中 SOD 酶活力的变化 Fig.3 Variation of SOD activity with fermentation time
2.5 玫瑰本草酵素发酵过程中总酚含量的变化
玫瑰酵素的总酚含量随时间变化曲线如图4所示。由图4可知:在发酵过程中,酚类含量逐渐增加,直到最高产量(发酵40 h)。与未发酵底物相比,该玫瑰本草酵素中总酚含量从8.68 mg/mL增至90.62 mg/mL,提高了9.44倍,这一结果与Dulf等[31]的研究结果相一致,可见发酵可提高产品中酚类化合物的水平。Ajila等[32]认为,酚含量和成分的增加可以归因于β-葡萄糖苷酶的作用,这是一种能够水解β-葡萄糖苷键的酶类,因此可以从其结合形式释放酚化合物。发酵过程中产生的酚类物质的变化取决于底物类型、使用的微生物以及发酵条件等[33]。
图4 发酵过程中总酚含量的变化Fig.4 Variation of total phenol content with fermentation time
2.6 玫瑰本草酵素发酵过程中果胶酶酶活的变化
玫瑰本草酵素发酵过程中果胶酶酶活的变化如图5所示。由图5可知:随发酵时间延长,果胶酶酶活呈现先升高再降低的趋势,并基本于发酵30 h后略有浮动;在玫瑰本草酵素发酵第20 h,果胶酶活力达到最大值,为(50.28±3.87) U/mL,较起始提高了3.55倍。发酵结束玫瑰花本草酵素果胶酶酶活为(48.21±4.43) U/mL。
图5 果胶酶酶活随发酵时间变化规律Fig.5 Variation of pectinase activity with fermentation time
2.7 玫瑰本草酵素发酵过程中纤维素酶酶活的变化
玫瑰本草酵素发酵过程中纤维素酶酶活的变化如图6所示。
图6 纤维素酶酶活随发酵时间变化规律Fig.6 Variation of cellulose activity with fermentation time
由图6可知:随发酵时间延长,玫瑰本草酵素的纤维素酶酶活先升高后降低,发酵至40 h时纤维素酶酶活从发酵初期的(4.32±1.18) U/mL升高至(30.80±1.63) U/mL,达到最高值,提高了6.13倍。
2.8 相关性分析
玫瑰酵素在发酵过程中均表现出相应的抗氧化能力,这可能是与玫瑰酵素中含有的SOD酶、总酚代谢产物有关,其相关性分析如表2所示。由表2可知:在玫瑰酵素发酵过程中,DPPH·清除率与·OH清除率之间呈极显著的正相关性(P<0.01);SOD 酶活与DPPH·清除率和·OH清除率相关系数分别为0.945和0.866(P<0.01),总酚含量与DPPH·清除率和·OH清除率相关系数分别为0.884和0.746(P<0.01)。纤维素酶活力与SOD酶活力和总酚含量相关系数分别为0.967和0.952(P<0.01),而果胶酶酶活与SOD酶活和总酚含量相关系数分别为0.669(P<0.01)和0.527(P<0.05)。这说明发酵过程中,产生的纤维素酶和果胶酶随发酵时间延长,酶活增加;SOD酶活和总酚含量水平与纤维素酶和果胶酶的酶活呈正相关性;与此同时,对应发酵时间的抗氧化性(DPPH·和·OH的清除率)表现出正相关性。
表2 相关性分析
2.9 玫瑰本草酵素肤质改善率的变化
皮肤是由活性氧和活性氮等活性物质引起的氧化应激的主要目标。这些活性反应成分(活性氧和活性氮)是皮肤色素沉着和皮肤老化的主要因素。一般认为具有抗氧化活性的物质具有抗衰老、美白和抗炎作用。紫外线辐射可诱导皮肤形成活性氧,如单线态氧和超氧阴离子,通过铁催化氧化反应促进暴露组织的生物损伤。这些活性氧自由基(ROS)可促进黑色素生物合成,损伤DNA,并可诱导黑色素细胞增殖。Yamakoshi等[34]发现氧化应激在皮肤疾病发病机制中作用的证据。众所周知,ROS清除剂或抑制剂如抗氧化剂可以减少色素沉着。此外,SOD是最重要的抗氧化酶之一,它催化超氧化物阴离子裂解为H2O2和分子氧。因此,本研究利用人群试验评价该玫瑰酵素对志愿者的肤色、淡斑、肌肤纹理及肌肤弹性等指标的影响,结果如图7所示。由图7可知:使用添加该玫瑰本草酵素后,30 d内受试者肤色、淡斑、肌肤纹理及肌肤弹性等指标均有所改善;该酵素可有效改善受试者肤色水平53.33%,淡斑改善可达42.67%,皮肤的纹理和弹性分别改善36.27%和25.43%。本实验结果将为评价酵素在抗皮肤衰老产品的功效、抗皮肤衰老产品原料的开发方面提供一定的理论和实验依据。
图7 玫瑰本草酵素对肤质改善率的影响Fig.7 Effects of rose enzyme on skin improvement rate
在本研究中,使用植物乳植杆菌、罗伊氏粘液乳杆菌及鼠李糖乳酪杆菌对重瓣红玫瑰、桑椹、玫瑰茄等进行发酵,制备了玫瑰本草酵素。该酵素的多酚、前花青素、乳酸、GABA、SOD酶活和游离氨基酸含量分别为38 mg/g、244 mg/kg、5.5×103mg/kg、562 mg/kg、33.2 U/mL和0.68 mg/g;与未发酵底物相比,玫瑰本草酵素对DPPH·及·OH的清除能力分别提高了0.43和1.09倍;抗氧化物质SOD酶活及总酚含量分别提升了5.79和9.44倍;果胶酶与纤维素酶的酶活分别提高了3.55和6.13倍。发酵过程中产生的纤维素酶和果胶酶随发酵时间延长,酶活增加;SOD酶活和总酚含量水平与纤维素酶和果胶酶的酶活呈正相关;与此同时,对应发酵时间的抗氧化性(DPPH·和·OH的清除率)表现出正相关性。通过30 d人群实验发现,该酵素可有效改善肤质(肤色水平53.33%,淡斑42.67%,皮肤纹理36.27%,皮肤弹性25.43%)。可见,玫瑰本草酵素具有美白抗氧化的功能,可通过乳酸菌发酵有效地用于生产高价值产品,预见其在保健、美容和医药行业具有潜在的用途。
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