◎ 张从党，王均华，王亚平，张维益，包静云
（江阴市食品安全检测中心，江苏 无锡 214400）
随着生活质量的不断提升，人们对优质肉类及产品的需求逐年上升。然而，仅通过肉眼观察难以分辨各类肉质的好坏[1-2]，一些经营者为牟取暴利，采取掺杂低廉肉品、注胶注水等手段，严重影响了食品安全[3-5]。鼠肉价格低廉，通常是不法商家的首选。然而，鼠肉携带多种病菌，含铅、砷等有毒有害物质较高，食用后会对人类健康造成严重危害，并增加疫病传播风险[5]。因此，对肉类及其制品中鼠源性成分的检测，是保障食品安全的重要环节[6]。对于鼠源性成分的检测方法，目前国内标准主要有GB/T 38164—2019《常见畜禽动物源性成分检测方法 实时荧光PCR 法》和BJS 201904 《食品中多种动物源性成分检测实时荧光PCR 法》[7-8]。
本研究旨在验证GB/T 38164—2019《常见畜禽动物源性成分检测方法 实时荧光PCR 法》在肉类食品中鼠源性成分检测上的适用性，并将其与其他鼠源成分PCR 鉴定方法进行对比，以提供肉类掺假鉴别的方法依据和技术支撑。
1.1 实验材料
本次实验所用鼠DNA 样品分别来自：1 号鼠DNA样品由中国检验检疫科学研究院馈赠（褐家鼠）；
2 号鼠DNA 样品由南京市食品药品监督检验院馈赠（Balb/c 小鼠）。小家鼠新鲜组织样本由本实验采购。
1.2 仪器与试剂
①仪器：荧光定量PCR 仪（CFX-96，BIORAD，美国），紫外分光光度计（SHIMADZU) ；
Dneasy mericon 食物核酸提取试剂盒（QIAGEN，德国）。②试剂：鼠种特异性基因测定试剂盒（荧光 PCR 法，北京良润）；
TaKaRa Taqman Real Time PCR 预混液（日本TAKARA 公司）；
引物与荧光探针均由南京金斯瑞生物科技公司完成。
1.3 样本处理及总 DNA 提取
生鲜肉组织用灭菌水进行简单冲洗，称取适量样品，并使用组织研磨仪进行研磨。采用离心柱型Dneasy mericon 食物核酸提取试剂盒，按照说明书操作，提取200 mg 肉制品中的总DNA，并命名为3 号鼠。
1.4 引物和探针
分别依据标准GB/T 38164—2019《常见畜禽动物源性成分检测方法 实时荧光PCR法》、BJS 201904《食品中多种动物源性成分检测实时荧光PCR 法》合成鼠成分荧光PCR 检测相应的引物及探针，序列见表1。
表1 引物探针序列表
1.5 有效性实验
根据GB/T 38164—2019 的实验方法，以3 号鼠的DNA 为模板，使用GBT 引物和探针进行PCR 扩增，以评价国标方法的有效性。PCR 反应体系如下：DNA模板2 μL（浓度为50 ng·μL-1），引物GBT 鼠-F/GBT 鼠-R 和 探针GBT 鼠-P 各1 μL，2×Premix Ex Taq 12.5 μL，灭菌双蒸水补足至25 μL。PCR 扩增条件分别为：95 ℃、30 s；
95 ℃、5s；
62 ℃、40 s，共40 个循环，在62 ℃时，采集荧光信号。
1.6 对比实验
根据BJS 201904《食品中多种动物源性成分检测实时荧光PCR 法》，以及鼠种特异性实时荧光PCR 检测试剂盒的实验方法，以3 号鼠DNA 为模板，进行相应的荧光PCR 扩增。通过对比2 种方法的扩增曲线和Ct 值，评估GB/T 38164—2019 方法的特异性。BJS 201904 方法使用BJS 引物和探针进行PCR 扩增，除了反应退火温度和时间外，PCR 反应体系和扩增条件与步骤1.6 相同。试剂盒的荧光PCR 反应体系及扩增条件，按照试剂盒说明书进行操作。
1.7 温度梯度实验
根据GB/T 38164—2019 实验方法，以3 号鼠DNA为模板进行实验。为了分析不同退火温度对实验结果的影响，本研究设置了6 种不同的退火温度。除了退火温度不同外，PCR 反应体系和扩增条件与步骤1.6相同。
1.8 适用性评估实验
根据GB/T 38164—2019 实验方法，分别以1 号鼠、2 号鼠和3 号鼠的DNA 为模板，使用GBT 引物和探针进行PCR 扩增，以评估国标方法在检测不同鼠源性成分上的局限性。PCR 反应体系和扩增条件与步骤1.6相同。
2.1 有效性实验结果
根据GB/T 38164—2019 的实验方法，以3 号鼠的DNA 为模板，使用GBT 引物和探针进行PCR 扩增，扩增结果见图1。从结果可知，GBT 引物和探针对目标基因无明显的特异性扩增曲线，说明GB/T 38164—2019 标准中的引物探针不具有良好的物种特异性，不适用于小鼠物种的鉴别。
图1 3 号鼠成分扩增曲线图
2.2 对比实验结果
分别用BJS 引物和探针及商品化的鼠源特异性PCR 试剂盒对3 号鼠DNA 进行荧光PCR 扩增反应，扩增结果见图2、图3。结果显示，BJS 引物和探针以及商业化的试剂盒，均出现了特异性的扩增曲线，进一步确认了实验室自提的3 号鼠样本中存在鼠成分。由此说明，GB/T 38164—2019 标准中的鼠引物及探针，不具有良好的物种特异性，不适用于小鼠物种的鉴别。
图2 BJS 201904 方法检测3 号鼠荧光PCR 的扩增曲线图
图3 商品化试剂盒检测3 号鼠荧光PCR 的扩增曲线图
2.3 温度梯度实验结果
根据GB/T 38164—2019 标准的实验方法设置6 种退火温度，分别为54、56、58、60、62、64 ℃，进行荧光PCR 扩增反应，扩增结果见图4。从结果可知，退火温度在54、56、58 ℃时，均有出现扩增曲线，高于58 ℃以后，就没有明显的扩增曲线。尽管如此，根据GB/T 38164—2019 标准要求，鼠的荧光PCR 退火温度应为62 ℃。
图4 不同退火温度对PCR 结果的影响图
2.4 适用性评估实验
采用GBT 引物和探针，根据GB/T 38164—2019 标准规定的鼠退火温度，对1 号鼠、2 号鼠和3 号鼠的DNA 进行荧光PCR 扩增反应，扩增结果如图5 所示。分析结果表明，仅有1 号鼠表现出特异性扩增曲线，2 号鼠和3 号鼠的DNA 未出现特异性扩增曲线，说明GB/T 38164—2019 标准中的鼠引物探针不具有良好的物种特异性，仅对大鼠有特异性扩增，不适用于小鼠物种的鉴别。
图5 不同鼠源性样本的荧光PCR 结果图
本研究旨在验证GB/T 38164—2019《常见畜禽动物源性成分检测方法 实时荧光PCR 法》，并评估其在肉类食品鼠源性成分检测中的适用性。通过对不同来源的鼠样品进行实时荧光PCR 检测，并结合其他实验方法，本研究证实了该方法能够准确检测肉类食品中的大鼠成分。但验证结果亦表明，该方法在检测不同鼠源性成分上存在局限性，仅能检测大鼠成分，不适用小鼠成分的检测，从而限制了其通用性。
此外，本研究也存在一定局限性。例如，鼠类样本种类较少，未涉及豚鼠、竹鼠、海狸鼠等常见鼠类动物的验证。因此，为提高鼠类成分实时荧光PCR 检测方法的通用性，未来的研究应进一步扩大样本量，分析不同鼠类间的基因多态性差异，设计适用于鼠类的通用引物和探针，并优化反应条件，以同时覆盖其他常见鼠类品种的荧光PCR 检测。
总之，本研究为相关检测机构提供了验证方法的借鉴，并为肉类食品中鼠源性成分的荧光PCR 检测提供了有益参考。未来，随着实验方法的不断完善和优化，实时荧光PCR 技术将在肉类食品中鼠源性成分检测方面展现更加广阔的应用前景。
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