李伟,江陶,冯雪莉,程吉兵,唐玲
(川北医学院附属医院,1.药剂科;2.骨科;3.检验科,四川 南充 637000)
结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是在临床上常见的一种消化系统恶性肿瘤,包括结肠癌和直肠癌[1]。目前认为,其发生的分子基础主要是原癌基因和抑癌基因表达水平的失衡[2]。有研究[3-4]报道,CRC发病数量达到193万例以上,占这一年确诊恶性肿瘤的9.7%,且其发病率排名第三,致死率排名第二,对CRC患者的生命造成严重威胁,因此寻找其发病机制进行具体研究至关重要[5]。补骨脂是一种中草药,而巴伐奇宁(bavachinin,BVC)是从补骨脂中提取出的一种活性黄烷酮类物质,研究[6]发现,BVC具有抗血管生成、抗炎等多种功能。Zhao等[7]研究发现,BVC可以诱导结肠肿瘤中细胞的凋亡。已有研究[8]发现,磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路在多种肿瘤的发生发展过程中具有重要作用。在胃癌中,激活PI3K/AKT/mTOR信号通路,会促进胃癌的进展[9]。因此,本研究基于PI3K/AKT/mTOR信号通路探究BVC对结直肠癌细胞恶性进展的影响。
1.1 实验细胞
人结直肠癌细胞系SW480细胞购自北京伊塔生物科技有限公司。
1.2 主要试剂与仪器
RPMI 1640培养基(上海富雨生物科技有限公司,货号:FY-PLS1368);BVC(艾美捷科技有限公司,货号:MBS3608190);Ly294002(江苏凯基生物技术股份有限公司,货号:KGR0049);740Y-P(武汉博欧特生物科技有限公司,货号:orb762808);胰蛋白酶(北京索莱宝科技有限公司,货号:X1020-10);96孔板(上海信帆生物科技有限公司,货号:XF-P3139);细胞计数试剂盒8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)(艾美捷科技有限公司,货号:BY-Q50356);PBS(武汉益普生物科技有限公司,货号:PB180521);AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(上海复申生物科技有限公司,货号:556547);6孔板(上海研谨生物科技有限公司,货号:J-SYA0352);基质胶(Matrigel)(上海研卉生物科技有限公司,货号:354234);Transwell(上海代轩生物科技有限公司,货号:3422);结晶紫(北京伊塔生物科技有限公司,货号:YT8810);蛋白裂解液(上海研谨生物科技有限公司,货号:RIPA20110527);总蛋白提取试剂盒(上海晶风生物科技有限公司,货号:31013-50T);BCA试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司,货号:PA115-01];PVDF膜(爱必信(上海)生物科技有限公司,货号:abs932);脱脂奶粉(上海联硕生物科技有限公司,货号:N/A-433);PI3K(货号:ab302958)、AKT(货号:ab278565)、mTOR(货号:ab109268)、GAPDH(货号:ab181602)抗体购自Abcam;CO2的细胞培养箱(Eppendorf艾本德中国,型号:000000002);酶标仪(美谷分子仪器(上海)有限公司,型号:SpectraMax iD3);流式细胞仪(赛默飞世尔科技,型号:A24858);倒置显微镜(Labcan Scientific,型号:DMi1);凝胶成像仪(上海金鹏分析仪器有限公司,型号:2020031203)。
1.3 细胞培养与分组
1.3.1 细胞培养 将SW480细胞接种在RPMI 1640培养基(含10%胎牛血清)中,在温度37 ℃,5% CO2的细胞培养箱中进行培养,定期对培养液进行更换(间隔2～3 d),观察细胞的颜色以及生长状态,并据此收集细胞进行传代以及后续实验研究。
1.3.2 细胞分组 将细胞在RPMI1640培养基(15%胎牛血清)中正常培养,未做任何处理的SW480细胞作为对照组,用10 μmol/L浓度BVC处理的培养基培养的SW480细胞为低剂量巴伐奇宁组(L-BVC组),用20 μmol/L浓度BVC处理的培养基培养的SW480细胞为中剂量巴伐奇宁组(M-BVC组),用40 μmol/L浓度BVC处理的培养基培养的SW480细胞为高剂量巴伐奇宁组(H-BVC组),用浓度为25 μmol/L PI3K抑制剂Ly294002处理的培养基培养的SW480细胞作为Ly294002组,用浓度为30 μmol/L BVC和10 μmol/L PI3K激活剂740Y-P共同处理的培养基培养的SW480细胞作为H-BVC+740Y-P组。
1.4 CCK-8试剂盒检测SW480细胞活性
收集1.3.2中各组培养至对数生长期的SW480细胞,用胰蛋白酶进行消化后接种在96孔板中,并加入CCK-8溶液,置于细胞培养箱(37 ℃,5% CO2)中进行培养,48 h后,用酶标仪对各组细胞的吸光值(OD450 nm值)进行检测。
1.5 流式细胞术检测SW480细胞凋亡
收集1.3.2中各组培养至对数生长期的SW480细胞,加入胰蛋白酶消化,消化后用预冷的PBS清洗,离心取沉淀,加入结合缓冲液对沉淀中的细胞浓度进行一定的调整,加入AnnexinV-FITC和PI,避光孵育10 min,用流式细胞仪对细胞凋亡情况进行检测。
1.6 划痕实验检测SW480细胞迁移能力
收集1.3.2中各组培养至对数生长期的SW480细胞,将其分别接种于6孔板中培养,培养24 h后使用枪头的尖端轻轻划动6孔板,继续培养,24 h后取出。分别在倒置显微镜下观察0 h和24 h的划痕,并观察细胞迁移情况,计算划痕愈合率(%)。
1.7 Transwell法检测SW480细胞侵袭能力
先取少量的经过4 ℃融化的基质胶(Matrigel)加入Transwell中进行预包被。收集1.3.2中各组培养的SW480细胞用培养基(不含血清)进行重悬,再加入Transwell上室中(已包被基质胶),在Transwell下室加入培养基(含10%胎牛血清),置于细胞培养箱(37 ℃,5% CO2)中培养24 h,多聚甲醛固定30 min,0.1%结晶紫染色,在显微镜下观察并拍照计算侵袭细胞数。
1.8 Western blot检测细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达情况
收集1.3.2中各组培养至对数生长期的SW480细胞,加入蛋白裂解液在冰上进行30 min裂解,裂解后离心取上清,对各组细胞提取总蛋白(总蛋白提取试剂盒),测定蛋白总量(BCA试剂盒)。将得到的蛋白质提取物利用SDS-PAGE凝胶电泳进行分离,转移到PVDF膜上,冰上反应1 h,清洗,5%的脱脂奶粉封闭30 min,清洗,分别加入(PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和GAPDH)抗体,4 ℃过夜;加入二抗,室温孵育2 h。用凝胶成像仪对蛋白表达情况进行观察。
1.9 统计学分析
2.1 BVC对SW480细胞增殖的影响
与对照组比较,L-BVC组、M-BVC组、H-BVC组、Ly294002组的OD值均降低,且随着BVC剂量的增加,OD值逐渐降低(P<0.05);与H-BVC组比较,H-BVC+740Y-P组的OD值显著增加(P<0.05)。见表1。
表1 BVC对SW480细胞增殖的影响
2.2 BVC对SW480细胞凋亡的影响
与对照组比较,L-BVC组、M-BVC组、H-BVC组、Ly294002组的细胞凋亡率均升高,且随着BVC剂量的增加,细胞凋亡率逐渐升高(P<0.05);与H-BVC组比较,H-BVC+740Y-P组的细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。见图1及表2。
表2 BVC对SW480细胞凋亡的影响
2.3 BVC对SW480细胞迁移的影响
与对照组比较,L-BVC组、M-BVC组、H-BVC组、Ly294002组的划痕愈合率降低,且随着BVC剂量的增加,划痕愈合率逐渐降低(P<0.05);与H-BVC组比较,H-BVC+740Y-P组的划痕愈合率显著升高(P<0.05)。见图2和表3。
表3 BVC对SW480细胞迁移的影响
2.4 BVC对SW480细胞侵袭的影响
与对照组比较,L-BVC组、M-BVC组、H-BVC组、Ly294002组的侵袭细胞数减少,且随着BVC剂量的增加,侵袭细胞数逐渐减少(P<0.05);与H-BVC组比较,H-BVC+740Y-P组的侵袭细胞数显著增加(P<0.05)。见图3及表4。
表4 BVC对SW480细胞侵袭的影响
2.5 BVC对SW480细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响
与对照组比较,L-BVC组、M-BVC组、H-BVC组、Ly294002组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR /mTOR比值均降低,且随着BVC剂量的增加,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值逐渐降低(P<0.05);与H-BVC组比较,H-BVC+740Y-P组的p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值显著升高(P<0.05)。见图4及表5。
表5 各组SW480细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白水平
目前,CRC的发病率呈现不断增加的趋势,给患者家庭及医疗卫生系统带来了沉重的负担[10-11]。临床上常用的治疗方式是以手术切除为主,靶向治疗以及化疗为辅,以此来提高患者的生存期[12]。随着社会的发展,手术技术不断提高以及化疗等辅助治疗方面也在不断进步,CRC患者的5年生存率也由原来的50%提高至65%,但仍未达到预期效果,需要进一步深入研究[13]。CRC发生发展的分子机制还不明确,因此,需要深入研究其发生发展涉及的相关机制,为CRC的早期诊断以及治疗提供理论依据。BVC是从中草药中提取得到的一种物质,已有相关研究发现,BVC也可诱导非小细胞肺癌中细胞的凋亡[14-15]。本研究中,使用不同浓度的BVC处理SW480细胞,发现BVC可以逐渐降低SW480细胞的OD值、划痕愈合率、侵袭细胞数,升高细胞凋亡率,表明BVC可以促进SW480细胞的凋亡,抑制细胞的增殖、迁移和侵袭。
PI3K是存在于胞质内的磷脂酰肌醇激酶,容易被一些刺激所激活,AKT是一种丝氨酸激酶,在细胞的生物学过程中发挥作用[16]。PI3K的激活会引起PI3K磷酸化的发生,AKT是PI3K的活化受体,会被磷酸化的PI3K招募并转运细胞膜上,AKT在多种酶的作用下,进行磷酸化,并参与细胞的调节,mTOR是PI3K/AKT的下游靶点,会被磷酸化的AKT激活,从而参与细胞生长的调控[17]。Fattahi等[18]研究发现,激活的PI3K会促使AKT的磷酸化,AKT磷酸化后进一步激活mTOR的磷酸化,从而参与肿瘤的发展。Han等[19]研究发现,激活PI3K/AKT/mTOR信号通路,可影响细胞自噬、凋亡以及相关炎症因子的表达。Deng等[20]研究发现,利用一定的药物对PI3K/AKT/mTOR信号通路进行抑制,会促进食道癌细胞的自噬及凋亡。本研究发现,与对照组相比,BVC处理后SW480细胞的p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值均显著降低,表明BVC可以激活PI3K,促进其磷酸化,进而促进AKT、mTOR磷酸化的发生,其作用与PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂Ly294002保持一致。随后进一步用PI3K/AKT/mTOR信号通路激活剂740Y-P进行回补实验,结果发现,H-BVC+740Y-P组OD值、划痕愈合率、侵袭细胞数显著升高,细胞凋亡率显著降低,同时740Y-P的加入也促进了PI3K/AKT/mTOR通路蛋白的磷酸化。由此推测BVC对结直肠癌细胞恶性进展的抑制可能与PI3K/AKT/mTOR信号通路被抑制有关。
综上,BVC对结直肠癌细胞恶性进展的抑制可能是通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路实现的。
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