裴正浩 王耿泽 夏西超 张虎 王钧 郝阳
(1南阳市中心医院胃肠外科,河南 南阳 473000;2平顶山学院医学院)
胃腺癌是起源于胃壁表层黏膜上皮细胞的消化道恶性肿瘤之一,多发生于胃窦、幽门、贲门等部位〔1〕。早期胃腺癌症状不显,诊断率低,大多数患者往往在晚期才被诊断出来,错过了最佳手术期,治疗效果大打折扣〔2〕。目前临床治疗晚期胃腺癌多通过辅助放化疗、分子靶向治疗和免疫治疗等方式,但因晚期胃腺癌患者多伴有远处转移和化疗抵抗〔3〕,放化疗的治疗效果较差,因此寻找胃腺癌治疗新的分子靶点意义重大。miRNAs是一类长度约为22个核苷酸的内源性小非编码RNA,被过往研究证实可作为胃腺癌治疗的有效靶点,参与调控胃腺癌的肿瘤进展〔4〕。miR-96-5p在胃腺癌患者血浆和胃腺癌细胞中过度表达,miR-96-5p通过靶向抑制叉形头转录因子的O亚型FOXO3表达,显著促进胃腺癌细胞的体外增殖〔5〕。miR-576-5p作为miRNAs家族的一员,尚不清楚其在胃腺癌细胞增殖、DNA损伤和耐药机制中发挥的具体作用。调控细胞黏附分子(CADM)2是类膜表面糖蛋白,参与维持细胞黏附、极性和肿瘤抑制等过程,在胶质瘤等实体瘤中异常表达,并影响肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭等细胞生命周期〔6〕。有报道称,CADM2可受miR-146a等miRNA调控,抑制肾透明细胞癌的细胞增殖、迁移和侵袭〔7〕。本实验旨在探究miR-576-5p调控CADM对胃腺癌细胞DNA损伤和化疗敏感性的影响。
1.1生物信息学分析 GSE26595、GSE158662和GSE61741数据集下载自GEO数据库,GEO2R软件分析差异表达基因。下载TCGA_STAD数据矩阵,分析miR-576-5p在胃腺癌组织中的表达水平。基因富集分析miR-576-5p与细胞增殖和DNA损伤的关系。miRNA数据库及靶基因分析软件PITA和microT在线预测miR-576-5p的下游靶基因,FDR<0.25时视为基因显著性富集。
1.2细胞培养和转染 人胃腺癌细胞系BGC-823和SGC-7901细胞购自美国菌种保藏中心,酒精消毒超净台后,将含有10%胎牛血清的DMEM培养基放置在超净台,将BGC-823和SGC-7901放入培养基中,并加入含1%青霉素和链霉素混合物的抗体,将培养置于二氧化碳浓度为5%,温度为37 ℃的恒温箱中,每隔48 h更换一次培养液,待细胞生长密度接近100%前对其进行消化传代,按照转染说明书(上海罗氏制药有限公司)将miR-576-5p质粒和对照miR-NC转染至BGC-823和SGC-7901细胞中,用G418筛选出稳定过表达miR-NC/miR-576-5p的BGC-823和SGC-7901,用于后续实验。按照转染说明书,在BGC-823/SGC-7901 miR-576-5p细胞中转染CADM2过表达质粒,仍然保持培养箱中二氧化碳浓度为5%,温度为37 ℃,孵育48 h后做后续实验。
1.3细胞计数试剂盒(CCK8)检测细胞活力 取经不同细胞转染后的对数生长期各组BGC-823和SGC-7901细胞,按照5×103个/孔接种于96孔板中,保持每孔中二氧化碳浓度为5%,温度为37 ℃,培养24 h后加入10 μl的CCK8溶液,使用微孔板酶标仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)检测各组细胞在波长450 nm处的吸光度值,分别于CCK8处理后的5 d内进行检测。
1.4实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中mRNA表达 采用TRIzol试剂(Invitrogen公司)将BGC-823和SGC-7901细胞中的总RNA提取出来,逆转录成cDNA后,使用便携式qRT-PCR仪(济南泰医生物技术有限公司)进行PCR检测,测定BGC-823和SGC-7901细胞中miR-576-5p(以U6作为标准化内参)和CADM2(以GAPDH作为标准化内参)的mRNA表达。miR-576-5p上游引物5′-TTGGGTCAAGAGTCAGAAGTTT-3′,下游:5′-TGGCTTCTACTTGTCCTTTCC-3′;CADM2上游引物5′-ATTTGACCACTGGAGGGAGG-3′,下游:5′-TTCCTTCCCCAGCCCTTTAG-3′;U6上游引物5′-AAAGCAAATCATCGGACGACC-3′,下游:5′-GTACAACACATTGTTTCCTC GGA-3′;GAPDH上游引物5′-ATCATCCCTGCCTCT ACTGG-3′,下游:5′-GTCAGGTCCACCACTGACAC-3′。
1.5Western印迹检测细胞中的蛋白表达 收集2×106个未经处理的BGC-823和SGC-7901细胞,用预冷的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞3次,将各组细胞裂解后以二喹啉甲酸(BCA)法测定上清液中的蛋白浓度。将各组细胞凝胶电泳后转移至聚偏氟乙烯膜封闭2 h,缓冲液洗涤3次后,加入CADM2和磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)一抗于4 ℃条件下孵育16～18 h,缓冲液洗涤3次后,加入辣根过氧化物酶标记的二抗,室温下孵育1 h,缓冲液冲洗后用超敏化学发光液显影,ImageJ软件分析CADM2和γH2AX蛋白灰度值。
1.6射线照射和免疫荧光 取对数生长期的BGC-823和SGC-7901细胞,更换新鲜培养基后,将细胞转移至含赖氨酸的盖玻片上,第2天按照国家次级标准剂量学实验室γ射线照射标准对BGC-823和SGC-7901细胞进行照射,剂量分别为0、2、4、5 Gy。
1.7双荧光素酶活性实验 构建野生型及突变型CADM2报告基因,按照上述转染步骤将miR-576-5p模拟物转染至BGC-823和SGC-7901细胞中,48 h后按照双荧光素酶试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)说明书操作,以测定各组细胞荧光素酶活性,验证miR-576-5p和CADM2的调控关系。
1.8裸鼠成瘤实验 将购买的18只无胸腺裸鼠饲养于装备有空气过滤装置的饲养笼中,保持28 ℃的恒温条件,维持相对湿度在40%左右,给予充足光照、饲料及洁净的水源,定期对饲养笼进行灭菌处理。将稳定表达miR-576-5p的BGC-823细胞消化高速离心后,PBS重悬后调整细胞密度为1×107个/ml。采用容量为1 ml的注射器将BGC-823细胞悬液沿裸鼠皮下进针后前行至腋下,每只裸鼠分别注射100 μl细胞悬液,待观察到皮下肿块形成后表明裸鼠成瘤模型构建成功,分别在成瘤后0～14 d时采用游标卡尺测量肿瘤最长直径和最短直径,肿瘤体积=(最长直径×最短直径2)/2,成瘤2 w后处死裸鼠,分离肿瘤组织,并称重。
1.9统计学分析 采用Graphpad Prism8软件绘制图表,SPSS22.0软件进行χ2检验、单因素方差分析及受试者工作特征(ROC)曲线。
2.1miR-576-5p在胃腺癌的表达 GEO R分析GSE26595和GSE61741的差异表达基因,其中GSE26595有21个上调基因,GSE61741有94个。对上调表达基因取交集,发现在hsa-miR-432、hsa-miR-576-5p、hsa-miR-224、hsa-miR-1246等4个共同上调的差异miRNA中,miR-576-5p在胃腺癌中没有被研究过。TCGA_STAD数据结果显示,miR-576-5p在肿瘤组织表达(4.01±0.72)显著高于癌旁组织(1.54±0.46;P<0.05)。ROC曲线表明,miR-576-5p对于胃腺癌的诊断有较高的临床价值〔曲线下面积(AUC)0.742,敏感度70.75%,特异性71.74%,95%CI:0.699～0.782,P<0.05〕。以miR-576-5p表达水平的四分位数分组,将TCGA中胃腺癌患者分为低四分之一和高四分之三两组,GSEA分析发现调控细胞增殖和DNA损伤相关基因集富集在miR-576-5p高表达组,表明miR-576-5p表达水平与细胞增殖和DNA损伤有关(FDR<0.25),见图1。
图1 miR-576-5p在胃腺癌中高表达,与胃腺癌DNA损伤和细胞增殖有关
2.2miR-576-5p在体内外促进胃腺癌细胞增殖 向胃腺癌BGC-823和SGC-7901细胞中转染miR-576-5p模拟物,qRT-PCR结果表明,与miR-NC组(0.97±0.08、1.00±0.10)相比,miR-576-5p组miR-576-5p表达(5.08±0.56、5.32±0.05)显著上调(P<0.05)。CCK8检测细胞活力发现,与miR-NC组相比,miR-576-5p组细胞活力显著增强(P<0.05),见表1。体内实验结果表明,miR-576-5p过表达显著诱导了胃腺癌BGC-823细胞的体内生长,肿瘤体积显著增加(P<0.05),见表2。成瘤2 w后,miR-576-5p组肿瘤质量〔(0.31±0.05)g〕显著大于miR-NC组〔(0.24±0.03)g;P<0.05〕。qRT-PCR检测肿瘤组织中miR-576-5p的表达,结果发现miR-576-5p在miR-576-5p过表达的肿瘤组织中(4.22±0.41)较miR-NC组(1.01±0.09)显著上调(P<0.05)。
表1 两组BGC-823和SGC-7901细胞活力比较
表2 两组不同时间点肿瘤体积变化
2.3miR-576-5p抑制胃腺癌细胞DNA损伤 免疫荧光法检测γ射线照射的胃腺癌BGC-823和SGC-7901细胞中γH2AX焦点形成情况,结果发现随着照射剂量的增加,γH2AX焦点数量显著减少(P<0.05)。Western印迹结果表明,与miR-NC组相比,miR-576-5p组γH2AX蛋白表达显著下调,且呈照射剂量依赖性,见图2、图3。
1～2:miR-NC组、miR-576-5p组
图3 两组不同剂量照射下γH2AX焦点数量(×4,双向电泳凝胶染色法)
2.4miR-576-5p抑制胃腺癌细胞对多柔比星的化疗敏感性 将不同浓度(0、0.001、0.010、0.100、1.000、10.000 μg/ml)的多柔比星处理胃腺癌BGC-823和SGC-7901细胞,CCK8检测细胞活力,结果发现与miR-NC组相比,miR-576-5p剂量依赖性抑制细胞活力(P<0.05),见表3。
表3 两组BGC-823和SGC-7901细胞对多柔比星的化疗敏感性比较
2.5miR-576-5p能够结合CADM2,且抑制其表达 PITA和microT在线预测MiR-576-5p的靶基因,并与GSE158662数据中胃腺癌表达下调的基因取交集(图4),CADM2、TOX、PRKACB、AK4、LRRC17、ERO1B、LIFR 7个基因表达下调(LogFC分别为-1.03、-1.31、-1.66、-1.80、-2.06、-2.32、-2.68)。下载TCGA_STAD数据,进一步对这7个基因分析,发现CADM2与细胞增殖和DNA损伤均相关(CADM2中位数分组)(图5)。miR-576-5p靶向并结合CADM2(图6)。与miR-NC组相比,miR-576-5p组CADM-WT-3′UTR(0.52±0.04)显著低于miR-NC组(1.01±0.09;P<0.05),CADM2-MT-3′UTR(1.00±0.11、1.01±1.00)无统计学差异(P>0.05)。与miR-NC组BGC-823、SGC-7901 mRN(1.01±0.08、1.00±0.09)相比,miR-576-5p过表达显著抑制了CADM2 mRNA(0.32±0.05、0.34±0.03)和蛋白表达(P<0.05),见图7。
图4 PITA和microT在线预测MiR-576-5p的靶基因,并与GSE158662数据中胃腺癌表达下调的基因取交集
图5 基因富集分析miR-576-5p与细胞增殖和DNA损伤的关系
图6 miR-576-5p靶向并结合CADM2
1～3:miR-NC组、miR-576-5p组、miR-576-5p+CADM2组
2.6miR-576-5p通过靶向结合CADM2促进胃腺癌细胞增殖 miR-576-5p过表达的BGC-823和SGC-7901细胞中转染CADM2过表达质粒,Western印迹检测结果发现,与miR-NC组相比,miR-576-5p组CADM2表达显著下调,而与miR-576-5p组相比,miR-576-5p+CADM2组CADM2表达上调,见图7。CCK8检测结果发现,与miR-NC组相比,miR-576-5p组细胞活性显著增强,而与miR-576-5p组相比,miR-576-5p+CADM2组细胞活性显著被抑制(P<0.05),见表4。
表4 3组BGC-823和SGC-7901细胞活性比较
胃腺癌是世界范围内最常见、最致命的恶性肿瘤之一,现阶段治疗胃腺癌的重要手段为放射治疗、化学治疗、分子治疗等,而肿瘤细胞的化疗敏感性降低是导致化疗失败的最主要原因〔8〕。随着对胃腺癌的不断探究,越来越多的研究发现,DNA损伤是引发胃腺癌等癌症的重要因素〔9,10〕。当DNA的双螺旋分子结构被破坏,DNA双链断裂,缺少完整的互补链作为修复模板,导致基因组稳定性降低,最终引发癌症〔11〕。然而对于肿瘤细胞而言,肿瘤细胞的DNA损伤可使其细胞损伤修复能力显著增强,进而影响肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。本实验发现,胃腺癌的DNA损伤和化疗敏感性的改变与细胞内miR-576-5p的异常表达有关,miR-576-5p通过靶向结合CADM2,抑制胃腺癌细胞DNA损伤,增强化疗抵抗性,促进细胞增殖,加速胃腺癌的恶性进展。
多种miRNA表达失调被证实与胃腺癌等恶性肿瘤增殖、迁移、侵袭、凋亡、上皮间细胞-充质转化和耐药有关〔12,13〕,Zheng等〔14〕研究发现,M2极化的肿瘤相关巨噬细胞miR-21外泌体可从巨噬细胞转移至胃腺癌细胞中,通过抑制PTEN基因表达,激活PI3K/AKT通路的磷酸化,抑制细胞凋亡,显著促进胃腺癌细胞对顺铂的耐药性。此外,也有报道显示,miR-21、miR-24和miR-421等miRNA在弥漫性胃腺癌组织中高表达,并成为DNA损伤应答的靶基因,通过调控APE1等活性氧诱导损伤修复基因及ATM、ATR和H2AX等DNA损伤识别基因的表达,影响胃腺癌的DNA损伤过程〔15〕。本研究结果与之较为相符,发现miR-576-5p在胃腺癌中高表达,过表达miR-576-5p可通过抑制DNA损伤,抑制胃腺癌细胞对化疗药物多柔比星的敏感性,促进胃腺癌细胞增殖。这可能与miR-576-5p对DNA损伤标志蛋白γH2AX基因的调控作用有关,miR-576-5p通过下调γH2AX的表达,通过直接修复、碱基切割修复和核苷酸剪切修复等多种途径保护肿瘤细胞免受化疗药物的DNA损伤效果〔16〕,抑制其化疗敏感性,诱导肿瘤进展。CADM2最初被认为是与肥胖和抑郁、焦虑、双相情感障碍等精神疾病有关的基因〔17〕,最新研究发现,CADM2可作为多种miRNA的下游靶点,与miRNA分子及多种蛋白和信号通路结合,参与影响多种恶性肿瘤的发生发展,在肿瘤中发挥维持细胞极性和抑癌的作用〔18〕。如miR-10b与CADM2的3′非翻译区结合,过表达miR-10b下调CADM2的表达,上调肝细胞Hep 3B细胞中FAK的表达,激活AKT信号通路,进而诱导肝癌细胞迁移和上皮细胞-间充质转化〔19〕。本研究也发现,CADM2是miR-576-5p的重要下游靶点,过表达miR-576-5p通过靶向抑制CADM2表达,抑制胃腺癌细胞DNA损伤,提高胃腺癌细胞对化疗药物的抵抗性,促进胃腺癌细胞体内外增殖。推测原因可能为,miR-576-5p作为CADM2的上游分子,通过促进CADM2启动子的甲基化,进而下调胃腺癌细胞内CADM2表达,而CADM2作为抑癌基因,通过破坏肿瘤细胞内分子结构的完整和稳定性〔20〕,在胃腺癌细胞DNA损伤修复中发挥显著的抑制作用,而miR-576-5p通过抑制其表达,进一步抑制了DNA损伤和对化疗药物的敏感性。本研究结果中,CADM2过表达逆转了miR-576-5p对胃腺癌细胞的促增殖效应也进一步证实了这点。
综上,miR-576-5p通过结合CADM2调节胃腺癌细胞DNA损伤和化疗敏感性,其机制是通过靶向抑制CADM2,抑制γH2AX蛋白表达来实现,最终发挥其显著的促癌效应,提示miR-576-5p/CADM2调节轴在胃腺癌细胞的DNA损伤和耐药中发挥重要作用。
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