王 蕾 赵邦哲 张迎燕 田若宁 王雅婷 李 昂 梅景良 连森阳 吴 旭
(福建农林大学动物科学学院(蜂学学院),福州 350002)
蛋壳质量是衡量蛋品质的一个重要指标,其不仅会影响到养殖场的经济效益,而且关系到食品安全隐患。蛋壳属性包括结构属性(蛋壳厚度、蛋壳强度、蛋形指数和超微结构等)和物质属性(蛋壳有机物、无机物和元素组成等)[1]。蛋壳的致密又多孔的结构可以满足胚胎与外界进行水蒸气、气体转换,并为胚胎提供足够的钙离子,还可以避免致病菌进入蛋内,保护胚胎免受外界不利因素的影响[2-3]。因此,改善蛋壳质量问题具有重要的经济价值和生物学意义。目前研究主要集中于饲养环境、营养供给、蛋壳品质性状候选基因和蛋壳沉积形成机制等方面,以此来改善蛋壳质量[1, 4-9]。现对于蛋壳元素组成、钙化壳基质含量和超微结构等研究日益深入。王佩伦[10]研究发现,低强度蛋壳中钙含量低而钠含量高;马玲玲[11]研究认为,高强度蛋壳具有更高的磷含量。宋凌子等[12]对鸡、鸭、鹅钙化壳的有机基质含量进行检测,在蛋壳破碎强度低的鸡蛋和鸭蛋的钙化壳中,4类基质的百分含量与蛋壳强度均无明显关联,而在蛋壳强度更大的鹅蛋壳中,4类基质的百分含量与蛋壳强度具有显著差异。张亚男等[13]和唐徐华等[14]认为,蛋壳超微结构决定着蛋壳的力学特性,影响蛋壳质量。龙岩山麻鸭作为福建省优良地方品种,具有体型小、产蛋量大、早熟、适应性强等显著特征[15]。而在高强度生产条件下,龙岩山麻鸭的蛋壳质量参差不齐,探求生产优质蛋已迫在眉睫。因此,本试验以龙岩山麻鸭作为研究对象,通过对蛋壳元素相对含量、基质含量的测定和扫描电镜观察,深入研究影响龙岩山麻鸭蛋壳质量的关键因素,为提高蛋壳质量,改善蛋品质提供新的思路,进一步促进龙岩山麻鸭养殖业的发展。
1.1 试验动物与饲粮
选取体况相近、健康状况相似的龙岩山麻鸭100只(300日龄),由龙岩山麻鸭原种场提供。试验期间试验鸭自由采食和饮水,单笼饲养,每天收集全部鸭蛋于4 ℃保存,试验期为2周,随机取白壳鸭蛋300个。试验山麻鸭饲喂玉米-豆粕型基础饲粮,参照《蛋鸭营养需要量》(GB/T 41189—2021)配制,其组成及营养水平见表1。
表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)
饲粮代谢能(ME)计算参照《中国饲料成分及营养价值表》(2022年第33版)。饲粮中粗蛋白质(CP)、钙(Ca)和总磷(TP)含量的测定分别参照《饲料中粗蛋白的测定 凯氏定氮法》(GB/T 6432—2018)、《饲料中钙的测定》(GB/T 6436—2018)和《饲料中总磷的测定 分光光度计》(GB/T 6437—2018)。氨基酸含量的测定参照《饲料中氨基酸的测定》(GB/T 18246—2019)。
1.2 蛋壳质量常规测定及试验分组
将收集到的300个鸭蛋进行消毒和编号。参照杨宁[16]方法测定蛋重(EW)、蛋形指数(ESI)、蛋壳厚度(EST)和蛋壳重量(ESW);蛋壳强度(ESS)使用蛋壳强度测定仪EFG-0503(日本Robotmation公司)测定,并根据蛋壳强度从高至低将300个鸭蛋分为高强度组、低强度组和中强度组,每组5个重复,每个重复20个蛋。最后,将这些蛋壳置于-70 ℃冰箱保存备用。
1.3 蛋壳有机基质的提取
随机选取高强度组、低强度组和中强度组蛋壳各30个,每组10个重复,每个重复1个蛋壳。参照宋凌子[17]方法稍作修改,提取蛋壳有机基质。蛋壳经过5%乙二胺四乙酸盐(EDTA-Na2)溶液浸泡、去膜、冲洗、烘干后分别研磨成粉后,加入15%乙酸提取3种有机基质组分,分别为酸不溶性基质(基质1)、水不溶性基质(基质2)和酸水兼溶性基质(基质3),3种基质组分的总和即为总基质。
1.4 蛋壳元素组成和超微结构
分别从各组中选取本组中蛋壳厚度相近的蛋壳各9个,每组3个重复,每个重复3个蛋壳。取所有样品蛋壳的中部面积(1 cm2)各1块,将其横断面粘于观测台上,从蛋壳的晶体层、栅栏层和乳突层各选取同等面积的3个区域,使用Kevex SIGMATMX射线能谱仪(理学研究所扶桑工业株式会社)测定样品蛋壳中各个元素的相对含量,取其平均值。测定后做喷金处理,置于S3400N型扫描电子显微镜(日本电子株式会社)下观察蛋壳各区域超微结构,并拍照保存。分别对蛋壳样品的乳突层有效厚度(ETML)和乳突间隙(MG)进行测量。乳突层有效厚度为乳突核心到2个乳突融合点的垂直距离,乳突间隙为相邻2个乳突单元融合点之间的距离。
1.5 数据统计与分析
本试验数据采用SPSS 26.0软件one-way ANOVA程序进行单因素方差分析,采用Duncan氏多重比较法检验组间差异显著性,P<0.05表示差异显著。结果均用平均值±标准差表示。
2.1 不同蛋壳强度组蛋壳质量
由表2可知,高强度组、中强度组、低强度组蛋壳强度差异显著(P<0.05);而各组间蛋重、蛋形指数、蛋壳厚度和蛋壳重无显著差异(P>0.05)。
表2 蛋壳质量测定结果
2.2 不同蛋壳强度组钙化壳基质含量
由表3可知,3个试验组钙化壳在蛋壳强度上存在显著差异(P<0.05),高强度组的蛋壳强度显著高于其他2组(P<0.05);而在高强度组、中强度组和低强度组间,总基质、基质1、基质2和基质3的含量均无显著差异(P>0.05),基质1含量是3种基质中含量最高的。
表3 不同蛋壳强度组钙化壳基质含量
2.3 不同蛋壳强度组蛋壳元素相对含量
由表4可知,在高强度组、中强度组、低强度组间,晶体层、栅栏层和乳突层的碳(C)、氮(N)、氧(O)、钠(Na)、镁(Mg)、磷(P)、硫(S)、钾(K)、钙(Ca)的相对含量均差异不显著(P>0.05)。3组内,各层氮的相对含量从低到高依次为:晶体层<栅栏层<乳突层;各层钙的相对含量由高到低依次为:晶体层>栅栏层>乳突层。相对含量较高的元素为钙、氧、碳、氮。
表4 不同蛋壳强度组蛋壳元素相对含量
2.4 不同蛋壳强度组超微结构
如图1所示,高强度组整体结构致密,乳突锥体小且排列紧密,乳突层与壳膜内层连接较紧密,晶体层、栅栏层和乳突层之间分界不明显(图1-A1)。中强度组整体疏松,其中晶体层和栅栏层排列较为紧密,但乳突单元之间排列不甚整齐,已经可以看到明显缝隙(图1-A2)。低强度组整体十分疏松,晶体层、栅栏层和乳突层分解明显,各乳突单元间隔明显增加,乳突层与壳膜内层连接不紧密,致密性差(图1-A3)。综合观察蛋壳横断面结构,随着蛋壳强度的降低,乳突单元间隙越大,乳突与壳膜层联系越疏松,气孔通道越长,致密性越差。
观察各组蛋壳乳突层发现,高强度组乳突顶部连接十分紧密,整个顶部周围的质地致密,有少量小的气孔洞,乳突层有效厚度最小,乳突间隙也最小(图1-B1、图1-C1);中强度组乳突顶部连接相对紧密,整个顶部周围的质地相对疏松且有较多大小不一的气孔洞,乳突层有效厚度相较于高强度组比较大,乳突间隙也略大(图1-B2、图1-C2);低强度组乳突顶部连接极为疏松,整个顶部周围的质地非常疏松且乳突锥体较中、高强度组蛋壳更小,乳突层有效厚度最大,乳突间隙也是最大的(图1-B3、图1-C3)。
通过对不同强度蛋壳超微结构的量化统计分析,由表5可知,高强度组、中强度组、低强度组间的乳突层有效厚度差异显著(P<0.05),高强度组、低强度组的乳突间隙差异显著(P<0.05)。
表5 不同蛋壳强度组超微结构测定结果
蛋壳强度主要是指蛋壳每平方厘米可以承受的抗压能力,蛋壳强度越高,蛋壳对压力的抵抗程度就越强,能更好地保持蛋壳的完整度和新鲜度。Solomon[18]指出,蛋壳厚度与蛋壳强度具有显著正相关,说明较厚的蛋壳具有较高的蛋壳强度。然而在本试验中发现,当蛋壳强度存在显著差异时,蛋壳厚度却没有明显的差异,说明蛋壳厚度并不是唯一影响蛋壳质量的因素,这与传统蛋壳质量评价体系认识相悖。同样,Blanco等[19]也证实了蛋壳厚度并不是决定蛋壳强度的唯一因素,加强了蛋壳的力学性不能通过简单的厚度测量来定义的观点。
蛋壳主要由94%～97%无机物质(主要是碳酸钙等)和3%～6%有机基质(主要是基质蛋白等)组成[20]。本试验所选蛋壳的钙、氧、碳元素相对含量均较高,但在不同蛋壳强度组间差异不显著,且其他所测定的元素相对含量也无显著差异,说明蛋壳强度并不取决于元素相对含量的高低,这与俞路等[25]研究结果一致。而与王佩伦[10]研究发现的蛋壳中钙沉积量的高低是影响蛋壳质量的关键,强度低的蛋壳中钙含量低而钠含量高以及马玲玲[11]研究所得高强度蛋壳具有更高的磷含量的结果均不一致。这可能与试验蛋壳来自不同禽类以及饲粮营养水平有关。本研究还发现,蛋壳中氮相对含量较高,而氮是基质蛋白的主要组成部分,基质蛋白可通过调节晶体生长和纤维网致密度来影响蛋壳钙化过程,从而影响蛋壳致密度[21]。但本研究氮相对含量的高低对蛋壳强度无显著影响,说明基质蛋白的含量并不是决定蛋壳强度的主要因素,可能是基质蛋白组成的不同对蛋壳强度产生影响。
钙化壳是禽蛋壳的主要结构,也是蛋壳抵抗机械损伤的重要贡献者。在蛋壳形成过程中,有机基质中有特定作用的蛋白质在蛋壳形成的每个阶段都存在于子宫液中,对于蛋壳的质地结构及其钙化过程有重要的调节作用,并影响蛋壳质量[21-22]。本试验结果表明,在不同蛋壳强度组的钙化壳中,4类基质的含量均无显著差异,这与Liu等[23]的试验结果一致,说明有机基质含量对蛋壳质量无显著影响。但有研究发现,蛋壳形成过程中不同蛋白谱可影响晶体的生长[24]。因此,有机基质的其他特性可能会调节蛋壳质量。根据以上分析,推断蛋壳强度的高低不取决于蛋壳元素相对含量和基质含量,而取决于蛋壳超微结构致密度,这与俞路等[25]观点相符。
蛋壳的微观结构类似于伞状结构,由内到外可分为蛋壳膜、乳突层、栅栏层、晶体层和胶护膜[26]。周光玉[27]和刘静静等[28]研究表明,随着蛋壳强度的增大,蛋壳表面皲裂纹数量减少,裂纹变浅,蛋壳内表面纤维结构、排布致密度增高,纤维间空隙面积减小,横断面结构致密性越好,这与本研究结果一致,说明蛋壳超微结构对蛋壳质量具有重要作用。然而有关超微结构不同层次对蛋壳质量影响的观点并不统一[29-31]。其中,俞路等[25]证明了乳突层有效厚度对蛋壳坚实度有重要影响,Bain[1]提出有效厚度是一种更有意义的评价蛋壳强度的方法。周光玉[27]研究显示,高强度组有效厚度与中、低强度组存在极显著差异。梁素芸[32]提出,乳突间隙也会对蛋壳强度造成很大的影响,高强度组的乳突间隙均小于中强度组和低强度组,这说明蛋壳乳突间隙越小,其蛋壳强度越大,与本试验结果一致。这说明乳突层才是决定蛋壳质量的主要结构,乳突层有效厚度和乳突间隙是影响蛋壳质量的重要因素。出现这种结果的原因可能是乳突是蛋壳钙化的开始部位,乳突层的结构影响着栅栏层和晶体层的排列[1],且乳突单元之间的融合点是断裂的起点,乳突层有效厚度越大,蛋壳内部结构越易被破坏。
综上所述,在本试验中,不同蛋壳强度组的龙岩山麻鸭蛋在元素相对含量和基质含量上无显著差异,而超微结构对蛋壳强度有较大影响。高强度蛋壳组的超微结构具有较小且少的空隙,乳突排列规则且紧密,乳突顶部与壳膜纤维层衔接良好,栅栏层和晶体层排列有序紧密等特点,其蛋壳强度明显优于其他2组。
① 蛋壳元素相对含量和有机基质含量对龙岩山麻鸭蛋壳强度无显著影响。
② 蛋壳超微结构致密度对蛋壳质量具有重要作用,其中乳突层有效厚度和乳突间隙是影响蛋壳质量的重要因素。
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