尹明秀 欧国进 陈剑 凤婧 赵虹
1四川大学华西第二医院检验科；
2四川大学华西第二医院出生缺陷与相关妇儿疾病教育部重点实验室，四川成都 6100412
胎儿新生儿溶血病（hemolytic disease of the fetus and newborn，HDFN）是指因母婴血型不合，母体针对与其不同的胎儿红细胞血型抗原所产生的相应抗体经胎盘进入胎儿血液循环，导致胎儿或新生儿同种免疫性溶血引起的一系列临床症状[1]。HDFN常导致早期流产，轻者出现胎儿或新生儿贫血、水肿、肝脾肿大，重者如果未经处理，可能导致胎儿重度贫血、严重的新生儿高胆红素血症与核黄疸甚至死亡[2-3]。ABO型新生儿溶血病（ABO-HDFN）是新生儿期最常见的疾病之一，是母体血液中产生的针对胎儿红细胞的IgG免疫抗体通过胎盘进入胎儿血液循环发生同种免疫而引起的溶血。临床上偶尔有IgG高效价抗-A（B）抗体引起严重的ABO-HDFN案例报道[4]，且有研究指出，O型孕妇IgG抗A（B）抗体效价与ABO-HDFN和高胆红素血症发生具有相关性[5]，随着抗体效价的增高，ABO新生儿溶血病患病率增加[6]。
提高新生儿/脐带血标本中红细胞抗体阳性检出率能更好地为临床提供诊断依据，便于ABO-HDFN早期诊断与治疗，降低其伤害。ABO-HDFN诊断依据主要为3项血清学试验：直接抗人球蛋白试验（DAT）、游离抗体试验和红细胞释放试验（即放散试验）。DAT阳性不能完全诊断HDFN，放散试验对新生儿ABO-HDFN的敏感度最高[7]，即放散试验检出抗体特异性是HDFN诊断的重要依据[8]。红细胞释放试验方法种类多，常用方法包括物理放散法（如冷冻复融放散、45℃热放散、56℃热放散等）和化学放散法（如甘氨酸放散、氯喹放散等）。我室一直采用冷冻复融放散法作为常规红细胞释放试验，其结果与临床吻合度较高；
但此方法因绝大多数红细胞已被破坏，获得的放散液颜色很深，后续只能进行试管法抗人球蛋白试验来进行抗体检测，该法需要多次洗涤细胞，操作步骤较多，结果判读也易受检测人员能力水平影响。传统56℃热放散法需要在孵育期间多次人工混匀，根据操作手法不同也会导致不同比例的红细胞破坏，获得的放散液也因颜色较深，后续抗体检测用微柱凝胶卡法不便于观察，最好进行试管法的抗人球蛋白试验。而改良56℃热放散法为上海市血液中心参比实验室采用的试验方法，此方法获得的放散液仅轻微溶血，后续可采用微柱凝胶卡法，更好进行操作标准化。本文主要探究改良56℃热放散和冷冻复融放散法对诊断ABO-HDFN是否存在差异，多方面探讨其是否可作为实验室的常规检测方法。
1 一般资料
选择2023年3月1日—2023年3月31日来我院就诊疑似ABO-HDFN 的新生儿患者。其中绝大部分患儿母亲血型为O型且父亲血型为非O型，以及少部分在外院生产而因高胆红素血症转入我院的新生儿，其父母ABO血型不一致的患儿。我院出生的新生儿采集EDTA抗凝脐带血4mL进行检测，若无脐带血则采集患儿静脉血3～4 mL进行EDTA抗凝。试验期间共收集445例标本，其中非O型新生儿263例，排除4例存在ABO外抗体，2例标本量少不能完成试验，1例血型抗原减弱，共有256例标本纳入试验和数据分析。
2 试剂与仪器
单克隆抗-A、抗-B-（江苏力博医药生物技术股份有限公司），反定A1细胞、B细胞、抗体筛查细胞（西班牙Diagnostic Grifols 公司），ABO-Rh血型检测卡、coombs卡（西班牙Diagnostic Grifols 公司），抗人球蛋白试剂（上海血液生物医药有限责任公司）和低离子液（珠海贝索生物技术有限公司），所有试剂均在有效期内。采用西班牙Grifols Erytra 全自动配血及血型分析仪、西班牙Grifols专用孵育器、西班牙Grifols专用离心机、日本久保田血清学离心机、安徽中佳低速离心机。
3 试验方法
将血标本1 000×g离心5 min，参照临床检验操作规程鉴定标本ABO及RhD血型。患者血浆标本进行游离抗体试验。取压积红细胞 2mL于洁净玻璃试管，加入3～5 mL生理盐水洗涤4～6次。将末次洗涤的生理盐水弃尽得到洗涤红细胞。用洗涤后的红细胞进行DAT试验和放散试验，放散试验同时采用冷冻复融法和改良56℃热放散法。
3.1 游离抗体试验
取Grifols Coombs卡标记1～3孔分别加入0.8%～1.0%标准A1细胞、B细胞和抗筛细胞50 μL，再加入患儿血浆25 μL于各孔，在Grifols专用孵育器孵育15 min后，于Grifols专用离心机离心9 min，观察和判读微柱凝胶卡结果。
3.2 直接抗人球蛋白试验（DAT）
取上述洗涤红细胞用生理盐水配制0.8%～1.0%红细胞悬液，加入50 μL于Grifols Coombs卡中，用Grifols专用离心机离心9 min后，观察和判读微柱凝胶卡结果。
3.3 冷冻复融放散试验
取0.5 mL上述洗涤红细胞与等量生理盐水在试管中混匀，盖上试管并旋转试管将细胞涂覆试管壁上，将试管水平置于-80℃冰箱冰冻10 min后取出，在37℃水浴箱的融化5 min。1 000×g离心3 min得上清液即放散液，将放散液转移到干净试管中，并与红细胞末次洗液做平行对照。随后进行试管法抗人球蛋白试验，即取2滴放散液、1滴3%～5%标准ABO细胞悬液、2滴低离子液，混匀，于37℃水浴15 min后，生理盐水洗涤4～6次，末次去尽上清后于试管内加入单克隆抗IgG抗体1滴，1 000×g 离心 15 秒后，人工判读试管法结果。
3.4 改良56℃热放散试验
取0.5 mL上述洗涤红细胞加入等量生理盐水制成50%红细胞悬液，于56℃恒温水浴箱中轻微震荡1 min后，再孵育9 min（注：标准热放散试验为将试管置于56℃孵育10 min，期间定期搅拌试管）。取出后1 000×g离心3 min得上清液即放散液，将放散液转移到干净试管中，并于红细胞末次洗涤的上清液做平行对照试验。随后进行微柱凝胶卡法抗人球蛋白试验法，即取Grifols Coombs卡加入50 μL 0.8%～1.0%标准A1细胞/B细胞，再加入放散液50 μL。于Grifols专用孵育器孵育15min后，再用Grifols专用离心机离心9min，观察微柱凝胶卡法结果。
4 结果判定
按照产品说明书，根据红细胞聚集在凝胶卡凝胶带上的位置判定阴阳性（阳性强度为±～4+，全部沉淀在凝胶卡底部为阴性）。
5 统计学分析
采用SPSS 26.0 软件对数据进行分析，计数数据采用比例（%）表示，组间比较进行χ2检验，等级资料比较进行非参数U检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。
1 平行对照结果
冷冻复融放散法和改良56℃热放散法均留取了末次洗涤的上清液作为平行对照，所有纳入试验的标本平行对照试验结果均为阴性。
2 改良56℃放散法和56℃放散法结果比较
因冷冻复融放散试验放散液为细胞破碎后所得，颜色为深红色，加入微柱凝胶卡后，无法判读结果，因此只能进行试管法抗人球蛋白试验。而改良56℃热放散试验大部分细胞没有破碎，所得上清液为浅红色，可以直接加入微柱凝胶卡，进行卡法抗人球蛋白试验。改良56℃热放散试验结果如图1所示。
图1 原56℃热放散与改良56℃热放散微柱凝胶卡法结果比较
同时对随机4个样本同时进行56℃放散法和改良56℃放散法，结果见图1。由图可以看出，末次洗涤上清液结果均为阴性，说明试验结果可靠，原56℃放散液颜色很深（因为红细胞已被破坏），而改良56℃放散液颜色更浅，更利于微柱凝胶卡判读结果，且相同试验条件下，改良56℃放散比原56℃放散法获得的结果阳性程度更高。
3 改良56℃热放散法微柱凝胶卡法结果图示
冷冻复融放散试验放散液为细胞破碎后所得，颜色为深红色，加入微柱凝胶卡后，无法判读结果，因此只能进行试管法抗人球蛋白试验，不便于结果拍照保存。原56℃放散法有部分红细胞破坏所得放散液颜色较深，微柱凝胶卡法抗人球蛋白试验结果不便于观察，一般也选择试管抗人球蛋白试验进行后续操作。而改良56℃放散法大部分微柱凝胶卡法细胞没有破碎，得上清液为浅红色，可以用微柱凝胶卡进行抗人球蛋白检测。试验结果对比如图1所示，对于游离试验强度为1+的2号标本，改良56℃放散法结果（凝集强度3+）比原56℃放散法结果（凝集强度1+）的放散效果更好。
4 两种放散方法阳性检出率比较
本试验中，256例样本中冷冻复融放散法的阳性率为64.45%，阴性率为45.55%。改良56℃放散法的阳性率为69.92%，阴性率为30.08%。两种方法比较P值为0.188，大于0.05，说明两种放散方法的阳性检出率无统计学差异。具体结果如表1所示。
表1 两种放散方法结果比较
5 两种放散方法不同凝集强度结果比较
比较两种方法检出阳性标本的凝集强度±～4+，统计学方法得出P值为0.058，大于0.05，无统计学差异，具体结果如表2所示。
表2 两种放散方法不同凝集强度结果比较
6 不同血型两种放散方法结果比较
纳入试验的256例标本中，A型145例，B型109例，AB型2例，其中AB型的2例标本两种方法检测均为阴性。A型冷冻复融放散法和改良56℃放散法的阳性率分别为77.24%和80.69%，P值为0.471；
B型冷冻复融放散法和改良56℃放散法的阳性率分别为51.38%和56.88%；
P值为0.35。不同血型两种方法的阳性率比较P值均大于0.05，两种放散方法的阳性检体结果如表3所示。
表3 不同血型两种放散方法结果比较
7 不同直抗结果两种放散方法结果的比较
本试验中，直抗阴性一共197例。冷冻复融放散法和改良56℃放散法的阳性率分别为54.31%和60.91%，P值为0.185；
直抗阳性一共59例，冷冻复融放散法和改良56℃放散法的阳性率分别为98.31%和100.00%，P值为0.315。不同直抗结果的P均大于0.05，故不同直抗结果两种放散方法结果无统计学差异。具体结果见表4。
表4 不同直抗结果两种放散方法结果的比较
8 不同游离抗体结果两种放散方法结果比较
纳入试验的256例标本中，游离抗体阴性共88例，冷冻复融放散法和改良56℃放散法的阳性率分别为11.36%和17.05%，P值为0.280；
游离抗体阴性共168例，冷冻复融放散法和改良56℃放散法的阳性率分别为92.26%和97.62%，P值为0.025，小于0.05，具有统计学意义，即当游离抗体阳性时，改良56℃放散法的阳性率高于冷冻复融放散法。具体结果见表5。
表5 不同游离抗体结果两种放散方法结果的比较
母婴血型不合是引起新生儿病理性黄疸的主要原因。有研究表明，母婴ABO和Rh血型不合引起的HDFN中，ABO血型不相容占85.3%[9]，远高于Rh血型系统，临床上需要尽早诊断并开展治疗，使疾病预后得到改善[10]，从而改善患儿的生存质量。红细胞抗体释放试验是诊断ABO-HDFN最有力的证据，阳性结果表明患儿红细胞被母体IgG抗A（B）抗体致敏。但放散试验比一般输血前检查更加精密，更容易受到检验温度、环境、操作规范等因素的影响[11]。
本试验在相同环境下进行，且操作人员相同，两种放散方法的阳性检出率约65%，差异无统计学意义，说明两种放散方法均适合用于检测ABO-HDFN。两种放散方法在不同凝集强度之间也不具有统计学差异，但存在细微差别。冷冻复融放散的凝集强度主要为±～2+，其中2+占比为41.2%，3+占比为10.3%；
改良热放散的凝集强度主要为1+～3+，2+阳性率为45.3%，3+阳性率为13.4%，说明改良热放散法检测效果更好更利于结果判读。对于检测不同血型样本，A型、B型两种方法的阳性率比较P值均＞0.05，说明两种放散方法的阳性检出率在不同血型上无统计学差异。但对不同血型阳性率进行分析我们可以看出，冷冻复融法A型和B型的阳性检出率分别为77.2%和48.6%，改良热放散法A型和B型的阳性检出率分别为80.7%和56.9%，两种放散方法A型的阳性率均远远高于B型，可能与红细胞上A位点的抗原决定簇略多于B有关，同时A抗原免疫原性强于B抗原，更容易诱导机体产生免疫应答，这与MATTEOCCI[12]、朱洁好[13]等研究结果一致。该试验中，不同直抗结果之间比较P值均＞0.05，得出不同直抗结果两种放散方法结果无统计学差异。但我们可以看出，直抗阳性标本放散实验检出特异性抗体均＞98%，故直抗阳性不能直接确诊发生了新生儿溶血病；
直抗阴性标本中放散实验检出特异性抗体均＞54%，故直抗阴性不能直接排除未发生新生儿溶血病。两种放散方法的比较结果均显示改良热放散阳性率稍高，但无统计学差异，提示加大检测标本量可能比较出两种方法的差异性。对游离抗体阴性和阳性时两种方法阳性率进行比较分析可知，游离抗体阴性时冷冻复融放散法和改良56℃放散法的阳性率分别为11.36%和17.05%，验证了游离阴性不能完全排除不存在ABO-HDFN；
游离抗体阳性的标本检测中，冷冻复融放散法和改良56℃放散法均有较高阳性率，分别为92.26%和97.62%，且二者存在统计学差异，说明此状态下改良56℃放散法的阳性检出率更高，漏检率更低，具有更好的临床诊断能力。比较原56℃放散法和改良56℃放散法可知，改良56℃放散法红细胞被破坏较少，更适合用于微柱凝胶卡检测，而原56℃放散法细胞破坏严重，放散液严重溶血，后续一般进行试管法的抗人球蛋白试验来进行抗体检测。
本研究在实验设计细节有不足之处，冻融复融放散法中红细胞完全溶解，由于压积红细胞和盐水等量，压积红细胞中细胞质完全释放后，相当于放散液被稀释了1倍。因此比较合理的比对是1份热放散液和2份冻融放散液的比对。此外，后续放散液的检测，改良56℃热放散液用微柱凝胶卡法、冷冻复融用试管抗人球蛋白法，两种方法的灵敏度不同，使用的抗人球试剂有较大差异，可能影响两种方法结果的比较。
两种放散试验对工作人员经验有不同的要求，且试验时间上存在差异。改良56℃热放散试验使用微柱凝胶卡法进行抗人球蛋白试验，试验结果的判读可以根据说明书准确判断，不存在人为差异；
而冷冻复融放散试验中只能进行试管法抗人球蛋白试验，有研究指出，微柱凝胶卡法抗人球蛋白试验的灵敏度要高于试管法，这种偏差可能是由于试管法测定血清抗体效价时需要反复清洗红细胞，操作辅助，易受人为因素影响[14]。回顾整个放散试验的过程，改良56℃热放散试验涉及几个流程，总耗时长约35 min，标本量对整体工作时间影响不大。冷冻复融放散试验涉及另外的固定流程，总耗时长大于40 min，因涉及样本洗涤，所以标本量越大所需时间越长。两种方法相比，冷冻复融放散法操作更为繁琐和耗时，对工作人员能力要求更高，而且需要-80℃超低温冰箱（注：根据本实验经验，-20℃冰箱冷冻时间达1 h才能达到-80℃冰箱冷冻10 min的相同效果）。和冷冻复融放散试验相比，改良56℃热放散试验操作更简便，人为因素影响较小，但需要配套的微凝胶Coombs卡、孵育器和离心机。大多数情况下，两种方法的放散结果一致，不同实验室可结合本实验室情况综合考虑和选择。
早诊早治HDN患儿可有效地控制病情进展并改善预后，缩短病程是最为重要的[15]。有研究表示新生儿溶血病检出率在出生后3 d内最高，随着日龄的增长，3项试验阳性率会逐渐降低[16-17]，因此需要尽早送检，做到早发现、早预防、早诊断、早治疗，降低ABO-HDFN对新生儿的危害。
本研究通过多方面比较改良56℃热放散法与冷冻复融放散法对于ABO-HDFN的诊断价值。各实验室可结合临床患者的紧急程度以及本实验室的仪器设备、耗材配置、工作人员经验和时间成本等综合考虑，选择适合本实验室的方法，以助力临床患者的诊疗，保障患儿生活质量安全。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
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