河北中医药大学
吴江立 贾玉涛△ 代 成 周伟伟 李爱英(石家庄 050091)
提要 目的：观察归脾汤对慢性心肌缺血大鼠氧化应激和凋亡的影响。方法：40只SD大鼠分为4组：正常对照组、模型组、归脾汤低剂量组、归脾汤高剂量组。除对照组外，其余各组经高脂饲料喂养和腹腔注射异丙肾上腺素建立慢性心肌缺血大鼠模型。归脾汤给药15 d后，苏木精-伊红(HE)染色观察心脏病理学形态变化，ELISA法检测心脏组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平，免疫组化检测活化的半胱天冬酶-3(Cleaved caspase-3)、BCL-Associated X(Bax)和B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)的表达。结果：HE染色结果显示，与对照组相比，模型组大鼠心肌组织排列紊乱，伴炎性细胞浸润，心肌坏死。与模型组相比，归脾汤低、高剂量组大鼠心肌组织受损程度减轻。与对照组相比，模型组大鼠心脏中SOD和GSH-Px含量下降(P<0.05)，CAT水平下降不显著(P>0.05)，MDA含量升高(P<0.05)。与模型组相比，低、高剂量归脾汤组大鼠心脏中SOD和GSH-Px水平升高(P<0.05)，MDA水平降低(P<0.05)，低剂量归脾汤组大鼠心脏中CAT水平升高(P<0.05)。免疫组化染色结果显示与正常组大鼠相比，模型组大鼠心肌组织中Cleaved caspase-3和Bax表达增多(P<0.05)、Bcl-2表达降低(P<0.05)，与模型组相比，低、高剂量归脾汤组大鼠心脏中Cleaved caspase-3和Bax的表达降低(P<0.05)，Bcl-2表达增高(P<0.05)。结论：归脾汤可以减轻心肌缺血损伤，保护心肌，其机制可能与抑制氧化应激、降低细胞凋亡有关。
随着人们生活水平的越来越高，饮食和生活方式的改变，冠状动脉粥样硬化心脏病(冠心病)的发病率越来越高。冠心病是由于冠状动脉发生粥样硬化，血管变窄，进而导致心肌缺血、缺氧而引发心肌受损、坏死的一类心脏病。该类缺血性心脏病致死率高，严重危害了人们的生命健康。中药具有多靶点、毒副作用小等优势，在治疗心血管疾病方面前景光明。心肌缺血在中医学中隶属于“胸痹”“心悸”等范围[1]。归脾汤主治气血两虚证，在临床上主要用来治疗冠心病、高血压、心力衰竭等疾病[2-3]。本研究拟探究归脾汤对慢性心肌缺血损伤大鼠的保护作用及机制，也为冠心病等缺血类心脏病的治疗提供新的思路。
1.1 实验动物 健康SD大鼠购自河北医科大学实验动物中心，合格证号：SCXK(冀)2013-4-003。
1.2 主要药品及试剂 归脾汤(黄芪20 g，茯神、龙眼肉、人参 、酸枣仁、大枣、炙甘草各15 g，当归、白术各12 g，远志、木香各8 g，生姜6 g)采用水煎法来制备，156 g药物加水煎煮2次，最后合并水煎液分别为50 mL和100 mL，对应生药量为0.78 g/mL和1.56 g/mL。Rabbit anti Cleaved caspase-3购自Affinity公司；
B淋巴细胞瘤 -2(Bcl-2)、 BCL-Associated X (Bax)抗体购自武汉塞维尔生物科技有限公司；
免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；
BCL-Associated X (Bax)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.3 动物实验造模及分组 大鼠慢性心肌缺血动物模型参考文献[4]的方法进行。造模结束后给药治疗，为期15 d，归脾汤低、高剂量组每天分别灌7.52、15.04 g/kg的归脾汤，正常对照组和模型组灌胃等体积的生理盐水。
1.4 HE染色观察心肌病理学改变 将心脏置于4%多聚甲醛溶液固定，随后经75%、80%、95%、100%酒精依次脱去组织中水分，二甲苯透明、石蜡浸透、包埋成组织块，在切片机上切成7 μm厚度的切片，经二甲苯脱蜡复水、进行HE染色，中性树胶封片并在显微镜下观察拍照。
1.5 心脏组织SOD、MDA、CAT和GSH-Px的测定 收集心脏组织并匀浆，离心收集上清液，根据试剂盒说明测定上清液中SOD、MDA、CAT和GSH-Px的含量。
1.6 免疫组化检测Cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表达 切好的石蜡切片经二甲苯脱蜡、酒精复水、高压锅加热修复抗原，滴加3% H2O2阻断内源性过氧化物酶，血清封闭，一抗孵育过夜、PBS清洗后滴加辣根酶标记的二抗，DAB显色，再进行苏木素复染后，封片观察。
2.1 心肌组织病理染色结果 心脏组织HE染色结果显示，正常对照组心肌组织排列整齐、染色均匀，未出现炎性细胞浸润。模型组心肌纤维排列杂乱，心肌间质内现大量炎性细胞，心肌组织坏死。低、高剂量归脾汤组心肌组织炎性细胞减少、心肌排列较整齐，心肌损伤有所减轻。详见图1。
图1 各组大鼠心脏组织形态学变化(HE，×200)
2.2 心脏氧化-抗氧化状态的影响 与正常对照组相比，模型组大鼠SOD和GSH-Px水平降低(P<0.05)，MDA水平升高(P<0.05)。与模型组相比，低、高剂量归脾汤组SOD和GSH-Px水平升高(P<0.05)，MDA水平降低(P<0.05)。与正常对照组相比，模型组大鼠心脏CAT水平有所下降，但差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组相比，低剂量归脾汤升高了大鼠心脏CAT水平(P<0.05)。详见表1。
表1 各组大鼠心脏中MDA、SOD、CAT及GSH-Px水平的变化
2.3 归脾汤对缺血大鼠心脏组织中Cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2表达的影响 免疫组织化学染色显示，各组大鼠心脏组织细胞质中均可检测到Cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2的阳性信号。与正常对照组相比，心肌缺血模型组大鼠心脏组织Cleaved caspase-3和Bax蛋白表达增多，Bcl-2蛋白表达降低。与模型组相比，归脾汤低、高剂量组大鼠心脏组织Cleaved caspase-3和Bax蛋白表达下降，Bcl-2蛋白表达升高。详见图2、表2。
表2 各组大鼠心脏中Cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax 蛋白平均光密度值
图2 免疫组化检测Cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白在心脏中的表达(免疫组化，×200)
随着人们生活水平的逐渐提高，冠心病的发病率逐年升高，若不及时控制，可发展为心肌梗死，严重者会出现猝死。中医学中并无“心肌缺血”这一病名，将其归属于“胸痹”“真心痛”“心悸”等范畴。《金匮要略》记载：“阳微阴弦，即胸痹而痛。”该病病位在心，涉及肝、肾、脾。病机为本虚标实。心血不足，心脉失于濡养、阴阳亏损为本虚，寒、痰、血瘀为标实。气虚则不能帅血，血虚则不能载气，脉道不充盈，滞于脉络则发病。国医大师路志正[5]认为脾胃失调是冠心病的主要病机，脾胃生化不足，气血亏虚；
脾胃运化失常，膏浊痰湿致心脉壅塞。在治疗时选用具有健脾益气、养心安神功效的归脾汤[6]，该方由人参、茯神、龙眼肉、白术、酸枣仁、黄芪、当归、甘草、远志、木香、大枣、生姜组成。黄芪和龙眼肉补脾益气以生血为君药；
人参、当归、白术、酸枣仁益气补脾、安神宁心为臣药；
远志、茯神交通心肾，木香理气，炙甘草益气补脾，复中焦运化之功，为佐使；
加之大枣和生姜调理脾胃，诸药配伍使用，既能补脾益气，又可养心补血。脾旺则血生、心血生则胸痹除；
气为血之帅，气旺则血生，血足则养心，心有所养，则疾病得除。
心肌缺血的病理生理机制比较复杂，涉及血管内皮细胞功能障碍、氧化应激、心肌细胞能量代谢异常、炎症和细胞凋亡等。心肌组织HE染色显示心肌出现大量炎性细胞，炎症反应不仅会导致氧化应激的产生，引起心肌细胞的氧化损伤，也可引起心肌细胞凋亡，最终使心肌细胞坏死。心肌缺血发生时，体内的促氧化和抗氧化作用失衡，活性氧(ROS)生成增加、激活氧化应激，进一步加重心脏损伤[7]。心脏中的SOD、CAT和GSH-Px是细胞内重要的抗氧化酶，可以清除体内的超氧化物和自由基。MDA是脂类物质氧化的产物，过多的MDA又会反过来诱导ROS的生成，破坏细胞DNA和蛋白质，使SOD和GSH-Px等酶的活力进一步降低。MDA含量的多少表示机体受到ROS损伤的程度，SOD、CAT和GSH-PX的活性则反映了机体内抗氧化防御系统能力的强弱。本研究中，模型组大鼠心脏中MDA含量增加，说明缺血激活了氧化应激，过多的氧自由基使脂类物质发生氧化；
SOD、CAT和GSH-Px活性降低，说明缺血导致细胞的抗氧化防御系统受损，归脾汤给药治疗后心脏MDA含量下降，SOD、CAT和GSH-PX活力升高。刘丽等报道归脾汤化裁经验方可以提高脾虚型黄褐斑患者SOD水平、降低MDA水平[8]。周文静等研究报道归脾汤可通过升高肝脏GSH-Px和SOD水平减轻雷公藤所致肝损伤[9]。归脾汤的主要活性成分黄芪甲苷、人参皂苷、甘草酸等均可以抑制MDA生成[10]。本研究结果表明归脾汤通过减轻机体的氧化应激损伤来保护心肌缺血大鼠的心脏。
心肌缺血激活了氧化应激，导致ROS生成过度，过度的氧化应激可诱导心肌细胞发生凋亡，氧化应激引起线粒体膜电位下降，导致线粒体膜通透性增加，释放细胞色素C等蛋白质，激活半胱氨酸蛋白家族，启动Caspase级联反应，最终导致细胞凋亡[11]。Bax是一种促凋亡蛋白，Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，可与Bax竞争性结合，Caspase-3是凋亡的执行者，心肌缺血发生时往往伴随着心肌细胞的凋亡[12-13]。抑制心肌细胞的凋亡能够减轻心肌缺血损伤。免疫组化结果显示模型组大鼠心肌组织中Cleaved caspase-3和Bax蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低，与以往文献报道一致[14]，说明缺血诱导了心肌细胞的 凋亡，归脾汤给药治疗后降低了Cleaved caspase-3和Bax蛋白的表达，提高了Bcl-2的表达。高丽等报道归脾汤含药血清通过减少细胞凋亡来增加骨髓细胞存活率[15]。本研究结果表明归脾汤可能通过抑制心肌细胞凋亡，保护心肌缺血大鼠的心脏。
综上所述，归脾汤可通过抑制氧化应激、减少细胞凋亡，保护慢性心肌缺血大鼠的心脏。
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