王小龙, 张梦寒,汤全英, 邹文燕
空肠弯曲菌是一种人兽共患病病原菌,可以引起动物和人发生多种疾病。该菌广泛存在于鸟、禽、狗、猫等动物体内,可通过污染肉、奶及未经消毒处理的水而导致感染[1]。空肠弯曲菌是导致人类弯曲菌病的主要病原菌,其次是结肠弯曲菌[2]。空肠弯曲菌通常定植在禽类和其它牲畜的肠道系统[3],禽肉被认为是人类感染的首要来源。空肠弯曲菌的感染可引起胃肠炎,其主要临床症状表现为腹泻、腹痛、发烧、恶心等,大多数空肠弯曲菌感染都为自限性感染,某些特定的型别还可以导致吉兰-巴雷综合症和米勒费雪症候群[4-7]。
空弯多重耐药的快速增长已成为公共卫生关注的焦点。世界卫生组织已把氟喹诺酮耐药弯曲菌列为对人类健康威胁最大的6个高优先级耐药菌之一[8]。全基因组测序技术(Whole genome sequencing, WGS)在菌种鉴定,分型,进化分析和毒力及耐药特征方面均可应用[9]。故通过琼脂稀释法了解苏州市空肠弯曲菌的耐药表型,通过全基因组测序分析苏州市2018-2022年分离的空肠弯曲菌的耐药基因,毒力基因,及MLST分型等分子特征,建立本地空肠弯曲菌分子分型数据库,为空肠弯曲菌的防治和暴发溯源等提供数据支持。
1.1 菌株来源 受测的61株空肠弯曲菌,其中53株分离自2018-2022年本市苏州大学附属儿童医院、苏州市中医院、苏州大学附属第一医院及苏州大学附属第二医院等4家哨点医院监测点的腹泻病人肛拭子或粪便样本,另8株分离自本市同期食品安全风险监测任务中的生禽肉样本。对菌株按照年度分离顺序赋予实验室编号。药敏质控菌株空肠弯曲菌ATCC33560购于广东环凯公司。
1.2 主要仪器与试剂 改良CCD琼脂(英国OXOID公司);血平板(广东环凯公司); Campy微需氧产气袋(日本三菱株式会社);弯曲菌药敏板(琼脂稀释法,青岛中创汇科生物公司);DNA Tissue Kit核酸提取试剂盒(德国QIAGEN GmbH公司);Qubit dsDNA BR Assay Kit试剂盒(美国Life Invitrogen公司)。
医用恒温培养箱(大连冰山松洋生物公司);VITEK DENSIMAT浊度仪(法国梅里埃公司);EZ2 Connect 全自动智能样本提取工作站(马来西亚QIAGEN GmbH公司);Qubit 3.0 Fluorometer荧光定量仪(美国Life Invitrogen公司);Legend Micro 17 离心机(美国Thermo公司)。
1.3 试验及分析方法
1.3.1 药敏试验 将-80 ℃保存的待测菌株接种改良CCD琼脂平板,经42 ℃培养48 h后,转种血平板,用无菌棉签分别挑取血平板上生长良好的待测菌和质控菌,使用浊度仪测量菌液浓度达到0.5麦氏单位后用无菌稀释液再进行10倍稀释(取100 μL的0.5麦氏单位的菌液加到900 μL 的生理盐水中,充分混匀),将制备好的菌液(约3 μL)用八联排无菌加样器接种于药敏板微孔的琼脂表面,加样后将药敏板放入置有微需氧产气袋的培养盒中,37 ℃培养48 h后肉眼观察药敏板上每个培养孔中弯曲菌的生长结果,即可得出MIC(minimum inhibitory concentration)值。
所用琼脂稀释法弯曲菌药敏板上包被有7类11种不同浓度抗生素的MH琼脂(含5%脱纤维羊血),可检测每种抗生素的MIC值。11种抗生素具体为:红霉素(ERY)、阿奇霉素(AZI)、萘啶酸(NAL)、环丙沙星(CIP)、庆大霉素(GEN)、链霉素(STR)、氯霉素(CHL)、氟苯尼考(FLO)、四环素(TET)、泰利霉素(TEL)及克林霉素(CLI)。结果参考2021年美国临床与实验室标准化协会CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)和美国国家抗生素耐药检测NARMS(National Antimicrobial Resistance Monitoring)推荐的耐药标准进行判定。对三类及三类以上抗生素耐药者为多重耐药。
1.3.2 基因组DNA的提取 用接种环刮取血平板上转种培养后的新鲜培养物一满环,置于DNA Tissue Kit核酸提取试剂盒配备的G2 Digestion buffer中重悬,然后使用该提取试剂盒按程序经EZ2 Connect 全自动智能样本提取工作站提取核酸。用Qubit dsDNA BR Assay Kit试剂,对提取的核酸用Qubit 3.0 Fluorometer荧光定量仪测定其DNA浓度。
1.3.3 测序分析 将61株空肠弯曲菌提取好的基因组DNA送苏州金唯智生物科技有限公司进行测序。将测序获得的原始序列(Raw reads)在CLC Genomics Workbench 21.0.4软件上用Trimming模块去除adapter及低质量数据, 然后进行从头拼装(De Novo Assembly), 对组装后的contigs用菌株编号命名。
毒力基因分析基于毒力因子数据库(virulence factors database, VFDB)。耐药基因的查找采用CLC Genomics Workbench 21.0.4软件Find Resistance with Nucleotide DB功能,基于CARD数据库和ResFinder数据库。根据空肠弯曲菌MLST(Multi-locus sequence typing)数据库(https://pubmlst.org/organisms/campylobacter-jejunicoli)确定菌株的ST型别。用Excel 2010进行结果统计和数据分析。利用BioNumerics v8.1软件进行菌株毒力基因聚类图的绘制。利用CLC Genomics Workbench 21.0.4软件构建SNP(single nucleotide polymorphisms)系统发育树,参考菌株ATCC 33560(GenBank ID:CP019838.1),采用最大似然法。图形的注释及美化采用ChiPlot工具[10]。统计学分析采用SPSS 27.0软件,检验水准为α=0.05。
2.1 药敏试验及耐药基因分析 药敏试验结果显示,61株菌对11种抗生素耐药率排前3位分别是萘啶酸,四环素和环丙沙星,耐药率分别为90.2%,88.5%和73.8%,对红霉素100.0%敏感,对其余抗生素均有不同程度耐药。多重耐药(multi-drug resistance, MDR)率达到41.0%,有多达9种多重耐药模式,以四环素类+喹诺酮与氟喹诺酮类+氯霉素类为最常见多重耐药模式,占多重耐药的44.0%。耐药情况最严重的菌株对9种抗生素耐药涵盖了测试的7个类别。食源性的8株空肠弯曲菌,对萘啶酸和环丙沙星100.0%耐药,多重耐药比例达到了62.5%,与病例来源菌株的多重耐药率(37.7%)相比无统计学差异(χ2=0.887,P=0.346>0.05)。详见表1。
表1 61株空肠弯曲菌对11种抗生素药敏试验结果
耐药基因分析结果显示,61株菌共检出5类18种耐药基因。其中cmeA,cmeC,cmeR携带率均为100.0%,其次是tetO,携带率为98.4%,携带率最低的为aph(2″)-If,携带率为1.6%。有6.6%的菌株携带了全部5类耐药基因。详见图1。
图1 61株空肠弯曲菌耐药基因分布热图Fig.1 Distribution map of drug resistance genes in 61 Campylobacter jejuni strains
2.2 毒力基因分析 61株空肠弯曲菌共检出97种毒力基因,涉及粘附、入侵、动力、外毒素、免疫调节5个功能模块。所有菌株毒力基因携带数量均在57种以上,最多的达到88种。5大功能模块中以免疫调节模块检出毒力基因数量最多,占83.5%。有47种毒力基因在所有菌株中都有检出,其中包括粘附模块的cadF、jlpA、PEB1,入侵模块的ciaB、ciaC,外毒素模块的cdtB、cdtC,免疫调剂模块的gmhA、mhB、hldD、hldE、waaC、waaF以及动力模块的34种毒力基因如flaC、flaD、flaG等。详见图2。
注:白色方块为未检测,彩色方块为检出。动力模块的flaC、flaD、flaG、flgB、flgC、flgD、flgE、flgF、flgG、flgH、flgI、flgK、flhA、flhB、flhF、flhG、fliA、fliD、fliE、fliF、fliG、fliH、fliI、fliL、fliM、fliN、fliP、fliQ、fliR、fliS、fliY、motA、motB、pflA等34种基因携带率均为100.0%,未在上图列出。
注:MDR为Multiple drug resistance缩写,CCs为clonal complexes缩写,ST为sequence type缩写,双短线“- -”表示未鉴定出CC型。
2.3 分子分型分析 61株空肠弯曲菌共检出42个ST型,总体呈现高度多样性。比例最高的ST型为ST464,占比9.8%,其次是ST6500,占比8.2%。62株菌包含12个克隆群,其中CC21占比最高,为19.7%,其次为CC464,占比14.8%,有14株菌未能通过PubMLST数据库鉴定出克隆群。25株多重耐药菌,涵盖了22个ST型。小于14岁的病例样本共计19株,涉及14个ST型别,多重耐药率为42.1%,14～60岁的病例样本共计30株,涉及25个ST型别,多重耐药率为40.0%,大于60岁的病例样本为4株,涉及4个ST型别,多重耐药率为0.0%。食源性样本共8株,涉及8个ST型别,多重耐药率为62.5%。不同来源的菌株型别较为分散,无明显的聚类特征。但同一ST型或CC型的菌株聚类在一起或是很临近的位置。
空肠弯曲菌在很多国家都是肠炎和腹泻的主要致病因素之一。弯曲菌的耐药率在世界范围内都在增长[11-12]。WHO将氟喹诺酮耐药弯曲菌列为研究和开发新抗生素的优先对象,优先级别为高级[8]。本研究中61株空肠弯曲菌对氟喹诺酮类抗生素CIP的耐药率达到73.8%,呈现出较高的耐药性。与Zhang D等报道的北京地区的医院分离株的CIP耐药率相近[12]。大环内酯类抗生素是目前临床推荐治疗弯曲菌感染的一线用药[13]。本研究中菌株对红霉素完全敏感,但对阿奇霉素有19.7%的耐药率。之前北京、温州、上海地区的空肠弯曲菌分离株对ERY和AZI均有较低水平的耐药,对红霉素的耐药率均在5.0%以下,虽然比例不高但提示已有耐药菌株存在[12-14]。本研究共发现了9种多重耐药模式,多重耐药率达到了41.0%。以四环素类+喹诺酮与氟喹诺酮类+氯霉素类为最常见的多重耐药模式,占总菌株的比例为18.0%,与Zhang P等报道的最常见的多重耐药模式相同,检出率也较为接近[15]。本研究中耐药基因与耐药表型之间呈现一定相关性,但两者并非完全一致。菌株对有的抗生素表现为表型耐药率低于耐药基因携带率,比如四环素类的表型耐药率为88.5%,耐药基因携带率为98.4%,可能与部分菌株相关耐药基因未表达有关[16]。菌株对另外有些抗生素表现为表型耐药率高于耐药基因携带率,比如没有发现林可酰胺类抗生素相应的耐药基因却有11.5%的菌株对CLI耐药。这种情况可能有两种原因。一是没有耐药数据库涵盖了全部的耐药基因,每个数据库都有自己的特点和局限性。二是与细菌复杂的耐药机制有关。细菌在个体层面主要有4种耐药机制:减少细胞内抗生素的浓度(降低渗透性和提升抗生素的外排);抗生素靶点的修饰或改变;抗生素的修饰或破坏;避开抗生素靶向的代谢途径[17]。本文的研究对象为革兰氏阴性菌,有研究表明革兰氏阴性菌的细胞膜的通透性在低速生长或稳定期的细菌耐药方面发挥主要作用[18]。对药物靶点的修饰也能改变细菌的耐药性[19]。这些耐药机制都是本研究所没有的涉及的。值得肯定的是,随着各项研究的深入开展和耐药数据库的不断扩展,耐药表型与基于基因分析的耐药推测之间将会有越来越高的一致性。
本研究中的空肠弯曲菌株所检出的动力相关基因多达41种。对空肠弯曲菌来说动力是必须的毒力因子,细菌通过运动达到肠窝的粘液层[20]。cdtABC编码CDT(Cytolethal distending toxin) ,能够通过影响肠隐窝细胞的分裂和分化明显的促进腹泻的发生。61株菌中有一株菌缺少cdtA基因但携带cdtB及cdtC基因,其它菌株均有携带cdtA、cdtB及cdtC基因。之前有报道从危及生命的腹泻病例中分离的空肠弯曲菌具有高的CDT检出率[21-23]。本研究中检出了LOS (Lipooligosaccharide) 的表达基因多达17种,分别为Cj1135、Cj1136、Cj1137c、Cj1138、cstIII、htrB、neuA1、neuB1、neuC1、waaV、wlaN、gmhA、gmhB、hldD、hldE、waaC、waaF,其中gmhA、gmhB、hldD、hldE、waaC、waaF的携带率为100.0%。之前有研究显示LOS与吉兰-巴雷综合征有关[7]。
61株菌共检出12个CC型,其中CC21为优势型别,与北京地区的临床分离株优势型别相同[12]。61株菌共检出42个ST型别,呈现高度多态性,之前报道的北京、上海地区的临床分离株MLST分型也呈现出了高度多态性[12, 14]。本研究菌株优势型别为ST464和ST6500占比分别为9.8%和8.2%。两种优势型别都在多个年份检出,具有一定的持续性,并且均为病例样本。同一ST型别的菌株往往聚类在一起,但ST464型中的菌株2020210和ST7469型中的菌株2020218在WGS聚类分析中更为接近,两者都是2020年8月在苏州市儿童医院腹泻病例中分离出来的菌株而且都属于CC464克隆群。同一ST型的菌株在遗传进化上不一定比不同ST型的菌株更为接近,因为空肠弯曲菌的ST型仅参考7个管家基因的序列,不能代表整个基因组的差异情况。Lavin A等报道WGS在暴发事件的调查中比脉冲场凝胶电泳(Pulsed-field gene electrophoresis,PFGE)和MLST分型具有更高的分辨率和更好的与现场流行病学资料的契合度[24]。
本研究显示苏州市空肠弯曲菌的MLST型别多样,菌株普遍携带较多的毒力基因,部分耐药基因检出率高,呈现较高的多重耐药性,暂未发现红霉素耐药菌株,可继续加强监测。
利益冲突：无
引用本文格式：王小龙, 张梦寒,汤全英,等.苏州市空肠弯曲菌耐药与分子特征分析[J].中国人兽共患病学报,2024,40(2):116-122. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2024.00.018
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