陈霭莹, 姜靖雯, 张 慧
（1. 广州中医药大学附属海南中医院，海南 海口 570100；
2. 海南省中医院肿瘤科，海南 海口 570100）
结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是消化系统最常见的恶性肿瘤，据统计，2020 年CRC 在全球癌症发病率中位列第3 位，国内发病率也呈逐年上升趋势，且发病年龄渐趋年轻化［1-4］。目前CRC的治疗方法主要包括手术、放化疗和靶向药物等，但患者术后胃肠神经功能紊乱、放化疗后消化道反应和皮肤神经感觉异常等不良反应的出现，对患者治疗耐受性有一定程度的影响，降低了CRC 患者的临床疗效和生存质量。现代临床研究［5］表明：中医药治疗在结肠癌治疗全程均可进行干预，与放化疗药物有效结合，在增效减毒、控制转移和复发、提高患者的生活质量、延长患者总生存期和肿瘤康复等方面具有良好效果。
中医学理论［6-7］认为：结肠癌的病因病机主要为六淫外侵，或饮食不节，或七情内伤，加之正气不足，脾虚失运，或先天脾肾不足，毒邪踞之，蕴结于大肠，肠道传导失职，凝聚成积。黄芩汤出自《伤寒论辨·太阳病脉证并治》“太阳与少阳合病，自下利者，与黄芩汤”，全方由黄芩、白芍、大枣和甘草4 味中药配伍而成，主治湿热下痢诸症，被奉为治痢之祖方，是临床肠癌治疗的常用方剂。方中黄芩“主诸热”，为全方主药，取其清热泻火解毒之功；
白芍酸苦敛阴和营止痛，与黄芩相伍，既泄肠中毒热，又敛营止痛，酸苦相施；
大枣、甘草与芍药合用可保津益气和中，缓急止痛。现代药理研究［8-10］显示：黄芩汤有抗炎、抑菌、调整肠道菌群、抗肿瘤和化疗药物减毒增效的作用。但目前黄芩汤治疗CRC 的分子靶点和作用机制仍未明确。
中药化学成分十分复杂，临床应用主以各种经验医学用药规律为原则，多药配伍来防治疾病，此特征使得中药现代化研究和开发利用难度大大提高。网络药理学由药理学、医学和统计学等多学科集成，通过系统和强大的数据库揭示药物治疗疾病分子机制的研究方法，通过构建“疾病-基因-蛋白-靶点-药物”网络，从整体上认识研究药物和疾病本质，与中药多成分、多靶点和整体性特点相呼应，是中医药现代化研究的有效方式［11］。本研究通过网络药理学和分子对接技术探讨黄芩汤治疗CRC 的可能生物活性成分和分子机制，为治疗CRC 的中药研究和应用提供理论依据。
1.1 黄芩汤有效成分和相关靶点筛选利用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform， TCMSP）（https：//old.tcmsp-e. com/tcmsp. php） 检索黄芩汤（黄芩、白芍、甘草和大枣）中药物化学成分，从中筛选口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且类药性（drug likeness，DL） ≥0.18 的有效成分，将所获得的活性成分靶点导入UniProt 数据库，通过设定的条件对其进行基因注释。
1.2 CRC 相关靶点筛选和黄芩汤潜在治疗靶点预测以“colorectal cancer”为关键词在GeneCards数据库（https：//www. genecards. org/）、疗效药靶数据库（Therapeutic Target Database，TTD）（https：//bidd. nus. edu. sg/ BIDD-Databases/TTD/TTD. asp）、人类在线孟德尔遗传（Online Mendelian Inheritance in Man， OMIM） 数据库（https：//www. omim. org）、 DrugBank 数据库（https：//go. drugbank. com/） 和药物遗传学和药物基因组学知识库 （Pharmacogenetics and Pharmacogenomics Knowledge Base， PharmGKB）（https：//www. pharmgkb. org/） 数据库中检索、汇总和去重，获得CRC 疾病相关靶点。将疾病靶点与黄芩汤活性成分靶点取交集，获得黄芩汤治疗CRC 的作用靶点，以此作为疾病和药物的共同潜在靶点， 并利用R 4.2.2 软件Venn 包绘制Venn 图。
1.3 构建疾病-药物-化合物-靶点网络利用Cytoscape 3.7.2 软件绘制黄芩汤中药复方调控网络关系图，采用Network Analyzer 插件进行分析，根据获取的介度（betweenness centrality，BC）、紧密度（closeness centrality，CC） 和连接度等拓扑参数的中位数对节点进行分析处理。
1.4 蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络构建和核心靶点筛选为研究黄芩汤治疗CRC 潜在作用靶点之间的相互关系，将筛选所得共同潜在靶点导入STRING 数据库（https：//cn. string-db. org/）， 物种来源设定为“Homo sapiens”，选择高置信度（置信度95%），构建靶点间相互作用的PPI 网络。再导入Cytoscape 3.7.2 软件进行网络拓扑分析，筛选PPI 网络核心靶点。
1.5 CRC 与黄芩汤交集靶点的基因本体论（Gene Ontology，GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路富集分析为了解黄芩汤治疗CRC 所涉及的生物学功能及相关通路，将药物疾病共有靶点进行GO 功能和KEGG 信号通路富集分析。使用R 4.2.2 软件，采用stringi 数据包，安装clusterProfiler、enrichplot 和ggplot2 等函数包进行GO 功能富集分析和KEGG 信号通路富集分析，采用Metascape（https：//metascape.org/）数据库对潜在靶点进行KEGG 信号通路富集分析作为数据补充。得出黄芩汤治疗CRC 的相关通路，采用R 4.2.2 软件进行可视化处理。
1.6 成分靶点分子对接为了进一步评估黄芩汤治疗CRC 的活性成分和受体靶点的可靠性，对其进行分子对接，分析其结合情况。由PubChem 数据库（https：//pubchem. ncbi. nlm. nih. gov/） 中下载活性成分小分子蛋白的分子2D 结构，采用ChemBio3D Ultra 软件对小分子化合物进行结构优化和能量最小化， 保存3D 结构信息并通过AutoDockTools-1.5.7 软件对小分子进行加氢和设置可旋转键等处理，作为分子对接的配体分子保存。在蛋白质数据库（Protein Data Bank，PDB）（https：//www.rcsb.org/）下载生物来源为人的关键基因蛋白晶体结构，采用PyMOL 软件去除靶蛋白水分子和原有配体，再通过AutoDockTools-1.5.7软件在蛋白受体上加氢和计算Gasteiger 电荷等处理，设置活性口袋后保存，作为分子对接的蛋白质受体。最后，利用AutoDock 软件将小分子配体与蛋白受体进行批量对接，通过PyMOL 软件将最优对接复合物进行可视化处理。
2.1 黄芩汤治疗CRC 潜在靶点预测根据 OB≥30%和DL≥0.18 的标准在TCMSP 数据库检索黄芩汤活性成分，共筛选出黄芩36 个、白芍13 个、大枣29 个和甘草92 个有效化合物，剔除重复和缺少靶点基因的化合物， 并根据被证实的“Reviewed”和人类来源的“Human”为条件对其作用靶点在UniProt 数据库进行注释校正，最终得到136 个有效成分和247 个对应作用靶点。采用GeneCards、 TTD、 OMIM、 DrugBank 和PharmGkb 数据库筛选CRC 疾病相关靶点，整合去重，共得出CRC 疾病相关靶点17 045 个（图1A）。将药物和疾病靶点整合取交集，得到黄芩汤治疗CRC 的潜在靶点242 个（图1B）。
图1 CRC 靶点Venn 图（A）和黄芩汤靶点与CRC 靶点Venn 图（B）Fig. 1 Venn diagram of CRC targets（A） and Venn diagram of Huangqin Tang targets and CRC targets （B）
2.2 构建黄芩汤-化合物-靶点网络将黄芩汤活性成分与靶点通过Cytoscape 3.7.2 软件绘制“黄芩汤-化合物-靶点”网络关系图（图2），共获得378 个节点和2 085 条边。连线表示黄芩汤中不同药物有效活性成分与潜在疾病作用靶点之间的相互作用关系，凹四边形代表潜在靶点，蓝色节点代表大枣活性成分，紫色节点代表黄芩活性成分，黄色节点代表白芍活性成分，红色节点代表甘草活性成分。成分-靶点间以“一对多”的相互作用关系为主，体现中药多靶点干预治疗的特性。按Degree值筛选得到20 个黄芩汤主要活性化合物（表1），其中槲皮素潜在治疗疾病靶点最多，有136 个，其次为山柰酚、汉黄芩素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、柚皮素、黄芩素、甘草查尔酮A、刺芒素、异鼠李素和美迪紫檀素。上述高连接度活性化合物可能在黄芩汤治疗CRC 中发挥主要药理作用。
表1 黄芩汤主要活性化合物Tab.1 Main active compounds of Huangqin Tang
图2 黄芩汤-化合物-CRC 靶点网络图Fig. 2 Network diagram of Huangqin Tang-compounds-CRC target
2.3 PPI 网络构建和核心靶点筛选为研究黄芩汤治疗CRC 潜在作用靶点的相互关系，将所获得的242 个黄芩汤治疗CRC 的潜在靶点导入STRING 数据库，设置人源性物种来源，默认其余参数设置，构建PPI 网络图（图3），再将结果导入Cytoscape3.7.2 软件进行分析，根据基因的BC、CC 和连接度中位值评分进行2 次筛选，最终得到18 个节点，157 条边（图4 和表2）。其中按Degree值排名前10 位的靶点为潜在核心作用靶点，即上述靶点在网络分析中处于核心位置，可能为黄芩汤治疗CRC 的核心靶点。
表2 黄芩汤治疗CRC 的潜在核心靶点Tab.2 Potential core targets of Huangqin Tang in treatment of CRC
图3 黄芩汤治疗CRC 潜在靶点PPI 网络图Fig. 3 PPI network diagram of potential targets of Huangqin Tang in treatment of CRC
图4 黄芩汤治疗CRC 潜在核心靶点图Fig. 4 Diagram of potential core targets of Huangqin Tang in treatment of CRC
2.4 GO 功能富集分析结果利用R 软件函数包对预测242 个CRC 潜在治疗靶点进行GO 的生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞组分（cell component，CC）富集分析，采用R 软件对结果进行可视化。BP 共富集2 654 条，主要与细胞对异生物应激反应、氧化应激反应和脂多糖反应等细胞调控有关联；
CC 富集147 条，主要与膜筏、膜微区和细胞质膜微囊等有关联；
MF 共富集272 条，主要与调控受体活性、配体转录因子激活和DNA 及RNA 相关转录因子结合等有关联。见图5。
图5 黄芩汤治疗CRC 潜在作用靶点GO 功能富集分析图Fig. 5 GO functional enrichment analysis diagram of potential targets of Huangqin Tang in treatment of CRC
2.5 KEGG 信号通路富集分析结果利用R 软件clusterProfiler 函数包的 enrichKEGG 函数和Metascape 数据库（人源） 对242 个潜在靶点进行KEGG 信号通路富集分析，共富集到183 条信号通路，富集结果见图6 和7。黄芩汤与CRC 交集潜在靶点通路富集主要涉及化学致癌因素-受体激活相关通路、 磷脂酰肌醇3- 激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT） 信号通路、化学致癌-活性氧通路、白细胞介素17（interleukin-17，IL-17）信号通路、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路和细胞凋亡及衰老相关信号通路等，上述通路与CRC 发生发展存在较强的相关性。
利用Metascape 数据库进行信号通路富集分析，结果显示：潜在靶点在癌症通路明显富集，结合函数包分析结果，主要涉及前列腺癌、肝细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、CRC 和膀胱癌。由此可知黄芩汤可通过作用于多个通路发挥抗CRC 作用。其中与CRC 相关的通路涉及基因共22 个，对其进一步行KEGG 信号通路富集分析，结果显示：22 个基因主要与内分泌抵抗、细胞凋亡、铂类药物耐药、 表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI） 抵抗、PI3K/AKT、细胞自噬和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK） 等信号通路有关联（图8）。将上述CRC 通路相关基因与核心基因取交集结果显示：黄芩汤可能通过调节蛋白激酶B1（protein kinase B1，AKT1）、MAPK3、原癌基因FOS、肿瘤蛋白P53 （tumor protein P53，TP53）和原癌基因MYC 等核心关键靶点发挥治疗CRC 的作用。将其通路可视化（图9），矩形框为基因/蛋白质节点，其中黄色节点代表AKT1，橙色节点代表MAPK3、FOS、TP53 和MYC，为黄芩汤对应作用的靶点蛋白。
图6 KEGG 信号通路富集分析图Fig. 6 KEGG signaling pathway enrichment analysis diagram
图7 KEGG 信号通路富集分析气泡图Fig. 7 Bubble diagram of KEGG signaling pathway enrichment analysis
图8 CRC 相关通路基因气泡图Fig. 8 Bubble diagram of CRC related pathway genes
图9 黄芩汤治疗CRC 核心关键靶点通路图Fig. 9 Core key target pathway diagram of Huangqin Tang in treatment of CRC
2.6 分子对接验证根据KEGG 信号通路富集分析中所得CRC 相关基因，与前述所得10 个核心靶点基因取交集，得出黄芩汤治疗CRC 的5 个核心靶点AKT1、MAPK3、FOS、TP53 和MYC。选取黄芩汤有效成分排序前5 位的化合物，即槲皮素、山柰酚、汉黄芩素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮和柚皮素作为小分子配体，利用AutoDock 软件进行两两对接验证，配受体结合能越低，提示结合活性越高且结合构象越稳定，结果显示：CRC 核心靶点与黄芩汤主要活性成分分子对接结合能均为负值，表明黄芩汤活性成分对于CRC 关键受体有良好的结合活性，可能在治疗CRC 过程中发挥重要作用（表3）。其中AKT1 与槲皮素对接效果最好，通过PyMOL 软件对其进行可视化（图10）。槲皮素与各靶点结合能均小于-5 kcal·mol-1，与各靶点均有较好的结合活性，且连接度值最高，可能是黄芩汤治疗CRC 的关键化合物。
表3 CRC 核心关键靶点与黄芩汤主要活性成分分子对接结合能Tab.3 Molecular docking binding energy of CRC core key targets and main active ingredients of Huangqin Tang
图10 AKT1 与槲皮素分子对接模型Fig. 10 Molecular docking model of AKT1 and quercetin
CRC 是消化系统常见肿瘤， 其发生发展过程是多因素和多基因交互作用的结果，“炎-癌转化”是主要发病机制之一，原癌基因和（或）抑癌基因突变、肠道菌群失调和组织炎性微环境等因素长期影响可诱导肠道慢性炎症反应，肠道组织出现“炎症-不典型增生-癌” 样改变， 最终发展为CRC［12-13］。临床研究［14-15］证实：黄芩汤在炎症性肠病，尤其是溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）治疗方面疗效明显。研究［10］证实：黄芩汤水提物PHY906 有抗肿瘤、抗炎和减轻化疗不良反应的作用。黄芩汤可抑制肠癌小鼠肿瘤组织中Notch和Wnt 信号通路，进而抑制细胞恶性增殖，预防炎性肠病的恶性转化［16］。张旖晴等［17］在观察黄芩汤治疗小鼠结肠炎相关结肠癌的研究中发现：黄芩汤治疗组较肿瘤诱导组小鼠肿瘤负荷和肿瘤体积明显减小。迟宏罡等［18］研究显示：黄芩汤处理后CRC SW620 细胞中促凋亡相关蛋白表达上调，抗凋亡相关蛋白及因子表达下调。宋振民等［19］观察黄芩汤联合化疗治疗84 例CRC 患者结果显示：黄芩汤联合化疗组患者临床疗效明显高于对照组。由此可见，黄芩汤可用于治疗CRC，其机制有可能与抗炎机制有关，但目前其分子机制尚未完全明确。
本研究共筛选出5 种黄酮类核心化合物，具有免疫激活、抗炎、抗肿瘤、抗氧化和抗耐药等生物活性，主要通过抗炎、抗自由基、直接抑制癌细胞生长和抗致癌因子发挥抗肿瘤作用［20］；
分子对接结果显示：5 种黄酮类化合物与核心关键靶点均对接良好。槲皮素以浓度依赖性方式抑制结肠癌SW480 细胞增殖，诱导其凋亡，阻滞细胞周期于G2和M 期，明显降低细胞黏附能力，从而产生抗癌活性［21］。YANG 等［22］研究表明：槲皮素呈浓度依赖性抑制结肠癌HT-29 细胞活性，并通过调节AKT/组成型光形态发生因子9 信号复合体亚基6（constitutive photomorphogenesis 9 signalosome subunit 6，CSN6）/MYC 信号轴诱导细胞凋亡。相关研究［23］表明：槲皮素通过上调凋亡基因，下调抗凋亡基因，促进大鼠CRC 细胞凋亡。还可通过抑制炎性结肠癌小鼠白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）/信号转导及转录激活因子3 （signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信号通路活性，降低炎性因子水平，进而抑制细胞恶性增殖［24］。有效成分山柰酚可通过诱导细胞周期阻滞和上调P53 蛋白表达及磷酸化使B 细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白家族中促凋亡因子 Bcl-2 相关 X 蛋白 （Bcl-2 associated X protein，Bax）表达水平升高，抗凋亡因子Bcl-2 表达水平降低，促进细胞凋亡发生，抑制结肠癌SW480 细胞增殖［25］。山柰酚可通过调节血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）/血管内皮细胞生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）及其下游PI3K/AKT、丝裂原活化的细胞外信号调节激 酶 （mitogen-activated extracellular signalregulated kinase，MEK）/细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）信号通路对VEGF 诱导生成的血管内皮细胞产生抑制作用，抑制血管生成［26］。研究［27］表明：汉黄芩素可调节凋亡因子Bax 和Bcl-2 表达水平，诱导结肠癌HT-29 和SW620 细胞凋亡，抑制作用呈浓度和时间依赖性，且部分高浓度给药细胞株中抑制作用优于5-氟尿嘧啶组，还可通过促进E-钙黏蛋白和抑制波形蛋白及Snail 蛋白表达进而抑制上皮-间质转化，降低肿瘤细胞侵袭和迁移能力。李彦萍等［28］研究发现：汉黄芩素可通过抑制Wnt/β-连环蛋白（β-catenin） 信号通路诱导CRC SW480 细胞凋亡。目前尚未见7-甲氧基-2-甲基异黄酮抗肿瘤活性的研究报道，但其与核心关键靶点对接活性良好，可作为后续进一步研究的理论基础。柚皮素可能通过调控Notch1 信号通路抑制CRC 细胞增殖分裂和侵袭，促进细胞凋亡［29］，在联合化疗药物治疗CRC方面也有良好的抗细胞增殖和迁移作用［30］。
本研究采用多个数据库联合筛选得到10 个核心靶点，进一步利用KEGG 信号通路富集分析，最终得到5 个黄芩汤治疗CRC 的核心关键靶点AKT1、MAPK3、FOS、TP53 和MYC，结合分子对接结果分析，AKT1 是其中最核心的靶点。AKT1 编码丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，在CRC 组织中高表达［31］，参与调节细胞增殖、生长和凋亡等过程。研究［32］表明：敲除AKT1 可使CRC 细胞增殖能力明显下降，还可逆转CRC 细胞上皮-间质转化状态。MAPK3 是MAPK 信号转导途径的重要组成部分，CRC 组织中MAPK3 表达水平降低，且与CRC 患者预后生存有关联［33-34］。抑癌基因TP53 主要通过诱导细胞凋亡发挥“细胞监查”作用［35］。原癌基因MYC 主要通过编码核内DNA 结合蛋白参与调控细胞周期和细胞分裂，在CRC 组织中过表达，可使癌细胞从G0和G1期进入S 期，促进癌细胞增殖［36］。本研究GO 功能富集分析和KEGG信号通路富集分析结果显示：黄芩汤抗CRC 可能通过癌症通路、化学致癌因素-受体激活信号通路、PI3K/AKT 信号通路、IL-17 信号通路、TNF 信号通路和细胞凋亡信号通路等，参与多种细胞应激反应，调节核受体活性、配体激活转录因子活性、DNA 结合转录因子活性和RNA 聚合酶Ⅱ转录调控等功能。
对癌症通路展开分析，得到与CRC 相关通路涉及22 个基因，对其进行KEGG 信号通路富集分析结果显示：CRC 相关通路与内分泌抵抗、细胞凋亡、铂类药物耐药、EGFR-TKI 抵抗、PI3K/AKT 信号通路、细胞自噬和MAPK 信号通路有关联，黄芩汤可能通过改善细胞耐药、诱导细胞凋亡和自噬等生物学功能发挥抗CRC 作用。本研究分子对接结果显示：核心关键靶点与核心化合物槲皮素、山柰酚、汉黄芩素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮和柚皮素均对接良好，表明黄芩汤主要活性成分对于CRC 各关键受体有良好的结合活性，可能在治疗CRC 中发挥重要作用，其中槲皮素与AKT1 结合能最低，二者结合最稳固，推测槲皮素与AKT1 受体结合后，通过PI3K/AKT 信号通路间接调控哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR） 信号通路，进而发挥抗CRC作用。
PI3K/AKT 信号通路与肿瘤细胞增殖、分化、凋亡、侵袭和迁移等生物学过程有密切关联。研究［37］证实：抑制PI3K/AKT 通路可使结肠癌HT-29 细胞出现细胞周期阻滞，抑制其生长增殖，促进其凋亡。PI3K/AKT 通路活化可促进基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）表达，进而使CRC 细胞发生侵袭和迁移［38］。mTOR 是PI3K/AKT 信号通路的下游蛋白靶点，主要与抗细胞凋亡、促进癌细胞迁移和耐药有关［39］。
本研究采用网络药理学和分子对接方法，初步探讨了黄芩汤治疗CRC 可能的潜在活性成分和作用机制，通过对接结果推测槲皮素和7-甲氧基-2-甲基异黄酮可能是其发挥抗CRC 作用的关键化合物，活性成分槲皮素与AKT1 结合可能通过PI3K/AKT 和mTOR 信号通路影响细胞增殖分化和细胞凋亡进程，发挥治疗CRC 作用，体现了中药多靶点和多通路的特点。本研究结果为临床应用黄芩汤治疗CRC 提供了理论依据。
利益冲突声明：
所有作者声明不存在利益冲突。
作者贡献声明：
陈霭莹参与研究设计、论文撰写、数据收集、统计学分析和绘制图表，姜靖雯参与写作思路拟定、指导论文撰写和论文修改，张慧参与论文知识性内容审阅和论文修改。
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