卜红宇 葛丽萍 王昆鹏 滕赟 韩峰
（内蒙古自治区药品检验研究院 内蒙古呼和浩特 010020）
随着我国经济的快速发展和国民收入水平的不断提高，化妆品已经成为了消费者的刚性需求，化妆品的安全性也受到广泛关注。化妆品在生产加工、贮存运输等各环节均有可能受到微生物污染。其中，金黄色葡萄球菌是一种重要病原菌，在自然环境中分布广泛，抵抗力强，是葡萄球菌属中对人类致病力最强的一种，能引起人体局部化脓性病灶，严重时可导致败血症[1]。《化妆品卫生规范》（2015年版）中将金黄色葡萄球菌列为化妆品常规检测项目，要求不得检出[2]。公共卫生实验室检验结果的准确性是控制产品质量的关键环节，其检测水平至关重要。能力验证是科学评价实验室检测和质量控制能力的有效手段，一方面可以确定实验室对检验项目的检测能力，另一方面可以发现和识别实验室存在的问题与风险，并启动改进措施，提高实验室的检测能力[3]。
为验证化妆品检验检测能力，内蒙古自治区药品检验研究院实验室参加了2022 年由中国食品药品检定研究院组织的NIFDC-PT-380 化妆品金黄色葡萄球菌能力验证，依据《化妆品卫生规范》（2015年版）[2]和NIFDC-PT-380 化妆品金黄色葡萄球菌能力验证作业指导书对盲样进行检测的基础上，同时参照《中国药典》2020 年版通则1106 金黄色葡萄球菌的检验方法[4]，SN/T 5228.3—2019《出口食品中病原微生物快速筛选方法 第3 部分：金黄色葡萄球菌MALDI-TOF MS 法》[5]，采用不同种类选择培养基进行分离，应用VITEK 2 微生物鉴定系统和MALDI-TOF MS 系统进行菌种鉴定。MALDI-TOF MS 是应用于微生物全细胞快速检测的技术，主要依据微生物特征蛋白指纹图谱分析，完成微生物的鉴定和分类。通过以上研究方法，探讨不同检验方法的检验过程及检验结果的差别与优缺点，进一步提高本实验室的微生物检测能力，同时为相关研究提供参考。
1.1 待测样品
NIFDC-PT-380 化妆品金黄色葡萄球菌检验能力验证样本2 份，编号为TC03800053 和TC03800054，由中国食品药品检定研究院提供。样品存放于西林瓶中，2 支西林瓶中各有一小团粉底膏包裹的1 个白色冻干菌球。
1.2 标准菌株
金黄色葡萄球菌（编号：CMCC（B）26003），表皮葡萄球菌（编号：CMCC（B）26069）。
1.3 培养基和试剂
SCDLP 液体培养基（广东环凯）；
Baird Parker培养基（青岛海博）；
血琼脂平板（广东环凯）；
金黄色葡萄球菌显色培养基（科马嘉）；
甘露醇氯化钠琼脂培养基（青岛海博）；
甘露醇发酵培养基（青岛海博）；
冻干兔血浆（广东环凯）；
冻干兔血浆（青岛海博）；
革兰阳性细菌鉴定卡（法国梅里埃）；
革兰阴性细菌鉴定卡（法国梅里埃）。
1.4 仪器设备
AC2-4SI 型生物安全柜（Esco 集团）；
MIR-554型培养箱（日本三洋公司）；
高压蒸汽灭菌柜（日本TOMY）；
超低温保存箱（海尔集团）；
漩涡震荡器（IKA）；
移液器（德国艾本德科学公司）；
AXIO Imager A2 显微镜（蔡司）；
VITEK2 Compact 全自动微生物鉴定仪（梅里埃）；
Autof ms 2000 全自动微生物质谱检测系统（安图生物）。
依据《化妆品卫生规范》（2015 年版）和NIFDCPT-380 化妆品金黄色葡萄球菌能力验证作业指导书的要求进行增菌、分离和生化试验鉴定。同时，参照《中国药典》2020 年版通则1106 金黄色葡萄球菌检查法，SN/T 5228.3—2019《出口食品中病原微生物快速筛选方法 第3 部分：金黄色葡萄球菌MALDITOF MS 法》，采用不同种类培养基进行检测，应用VITEK 2 Compact 全自动微生物生化鉴定系统和MALDI-TOF MS 全自动微生物质谱鉴定系统进行菌种鉴定，最终综合以上试验结果出具报告。
2.1 样品的前处理及增菌
在生物安全柜内打开装有样品的西林瓶，无菌操作向瓶内加入6 mL SCDLP，将样品完全混匀，使其分散混悬；
转移至灭菌试管中，用SCDLP 润洗西林瓶4 次，每次1 mL，最终试管中体积为10 mL。上述稀释液作为增菌液，于36℃静置培养24 h。依此方法分别处理2 份样品。
2.2 分离、纯化及染色镜检
轻轻震荡上述增菌培养液使其混匀，取1 接种环（10 μL），划线接种在Baird-Parker 琼脂、血琼脂培养基、金黄色葡萄球菌显色培养基及甘露醇氯化钠琼脂培养基上，于36℃培养48 h；
挑取单个疑似菌落分纯在血琼脂平板和胰酪大豆胨琼脂培养基上，必要时进行二次纯化，于36℃培养24 h；
挑取分纯菌落，涂片，进行革兰氏染色，镜检。
2.3 生化反应试验
甘露醇发酵试验：取分纯菌落接种至甘露醇发酵培养基中，在培养基页面上加入高度为2～3 mm的灭菌液体石蜡；
于36℃培养24 h，金黄色葡萄球菌应能发酵甘露醇产酸。
血浆凝固酶试验：取0.5 mL 待检菌24 肉汤培养物加入0.5 mL 兔血浆中，混匀；
置于36℃培养箱中，每0.5 h 观察1 次；
6 h 内如呈现凝块即为阳性。同时做血浆凝固酶阳性和阴性菌株对照。
2.4 VITEK2 Compact 鉴定
根据上述染色镜检结果选取相应的鉴定卡进行生化鉴定，操作按照法国梅里埃公司说明进行。
2.5 MALDI-TOF MS 鉴定
采用提取法鉴定：在1.5mL 离心管中加入300 μL去离子水；
取样本（在中等大小菌落中挑选1～2 个单菌落）于离心管中，充分振荡混匀；
加入900 μL 无水乙醇，充分混匀；
室温离心2～4 min（转速8 000～14 800 r/min），弃去上清，再次离心，使用移液枪完全除去上清，操作过程中不应接触沉淀；
37～40℃干燥沉淀2～5 min，至沉淀表面无明显水迹；
加入裂解液1（10 μL），振荡混匀；
加入同体积的裂解液2（10 μL），充分混匀；
室温离心2～4min（转速8000～14800r/min）；
吸取1 μL 上清液，滴加到样品靶上，并在室温下晾干；
晾干后，取μL 基质溶液覆盖在上述样品点上，并在室温下晾干；
将样品靶置于质谱仪内进行测定。
3.1 增菌和分离结果
样品TC03800053 和样品TC03800054 在SCDLP液体增菌培养基培养后，液体培养基均变浑浊，说明样品中存在微生物，需进一步进行分离培养。《化妆品卫生规范》（2015 年版）规定的分离培养基为血平板和BP 平板。由于多种选择性培养基同时使用，可以互相补充，提高结果的准确性，因此本试验还采用了金黄色葡萄球菌显色培养基和甘露醇氯化钠琼脂培养基。金黄色葡萄球菌显色培养基具有较高的特异性和灵敏度，可消除假阴性及假阳性。甘露醇氯化钠琼脂培养基的选用是依据中国药典（2020 年版）1107 金黄色葡萄球菌的检验，它对金黄色葡萄球菌也具有较高的特异性和灵敏度。
样品中微生物在分离培养基上的菌落特征见表1。由表1 可知，样品TC03800053、TC03800054 内分别含有2 种微生物，其中，TC03800053-1 和TC03800054-1在4 种分离培养基上均能够生长，在血平板上均为白色菌落，未见溶血环；
在BP 平板上菌落呈黑色，圆形，外层有透明带，但在菌落周围未见浑浊带；
在金黄色葡萄球菌显色培养基为无色或粉红色菌落；
在甘露醇氯化钠琼脂培养基上呈白色圆形菌落。因此需进一步鉴定。TC03800053-2 和TC03800054-2在BP 平板上未生长；
在金黄色葡萄球菌显色培养基呈蓝色；
在甘露醇氯化钠琼脂培养基上呈针尖状小菌落。因此，排除是金黄色葡萄球菌的可能。
表1 分离培养基上的菌落特征Table 1 Colony characteristics on isolation medium
3.2 革兰氏染色镜检和生化反应试验结果
对以上菌种进行革兰氏染色镜检、甘露醇发酵试验和血浆凝固酶试验，试验结果见表2。由表2 可知，TC03800053-1 和TC03800054-1 为革兰阳性球菌，但无法发酵甘露醇产酸，血浆凝固酶试验阴性；
未检出金黄色葡萄球菌。TC03800053-2 和TC0380 0054-2 为革兰阴性杆菌。表明样本TC03800053 和TC03800054 均未检出金黄色葡萄球菌。
表2 革兰氏染色镜检和生化反应试验结果Table 2 Gram staining microscopy and biochemical reaction test results
3.3 VITEK2 Compact 和MALDI-TOF MS 鉴定
为了确保结果的准确性，对分离纯化的菌株采用VITEK2 Compact 全自动微生物鉴定系统和MALDITOF MS 系统鉴定，结果见表3。由表3 可知，菌株TC0 3800053-1 和TC03800054-1 为表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis），TC03800053-2 和TC038 00054-2 为弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii），2种鉴定方法的结果一致，且VITEK2 Compact 鉴定结果可能性均高于95%，MALDI-TOF MS 鉴定结果得分均高于9.2 分（9～10 分为种水平可信）。这2 种方法的鉴定结果与《化妆品卫生规范》（2015 年版）规定方法检验结果一致，均未检出金黄色葡萄球菌。中国食品药品检验研究院能力验证结果报告通知单 结论为满意。
表3 VITEK2 Compact 和MALDI-TOF MS 鉴定结果Table 3 Identification results of VITEK2 Compact and MALDI-TOF MS
从NIFDC-PT-380 化妆品中金黄色葡萄球菌检出能力验证结果报告可以看出，共56 家实验室报名参加本次能力验证计划，其中52 家结果为满意，占92.9%，4 家结果为不满意，占7.1%。不满意原因主要为假阴性、假阳性结果，其中有2 家假阳性结果，2 家假阴性结果。化妆品金黄色葡萄球菌检验中导致假阳性的原因主要与人员操作有关，一方面可疑菌落的鉴定过程中某些生化实验的操作不正确导致鉴定结果错误，如将干扰菌表皮葡萄球菌误判为金黄色葡萄球菌，另一方面金黄色葡萄球菌在人的皮肤和环境中都有存在的可能，若在检验过程中，外界的葡萄球菌进入到检测体系中也可能会导致假阳性。化妆品中金黄色葡萄球菌检验中导致假阴性的原因与增菌液、分离平板等培养基质量以及实验人员在检测过程中的操作等有关，可能将金黄色葡萄球菌误判为藤黄微球菌、山羊葡萄球菌或沃氏葡萄球菌[6]。
因此，做好能力验证，需要从检测人员、检测设备、检测材料、检测方法、检测环境5 个方面进行质量控制，这样才能保证检验结果准确有效。例如，保证实验环境符合洁净要求；
操作人员具备专业理论基础和实践操作水平，保证无菌操作，避免来自操作人员和环境中的微生物污染和样品间的交叉污染；
做好试剂、培养基的质量控制，采用阳性对照，对培养基和生化试剂进行监控，可以采用多种选择性培养基，比如金黄色葡萄球菌显色培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基等作为补充手段，能够有效避免干扰菌的影响，提高检验结果准确性；
配置必要的微生物鉴定设备，培养基上的菌落形态判断要求检测者有丰富的检测经验，依靠操作者的主观判断，在不确定的情况下可采用多种鉴定方法进行佐证，如VITEK2 Compact 鉴定系统、MALDI-TOF MS鉴定系统、16S rRNA 基因测序鉴定[6]、基因指纹图谱鉴定[7]及实时荧光PCR 法鉴定[8-9]等方法。
综上所述，内蒙古自治区药品检验研究院具备化妆品中金黄色葡萄球菌检测能力，实验室人员的检验能力符合要求，实验室设备、环境、标准菌毒种、方法、样品等各要素正常运行并准确可靠。建议各实验室积极参加各种能力验证活动，以提高检测质量控制水平和实验室的技术能力[10]。
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