温国扬 ，罗文
1.广州中医药大学，广东 广州 510000；
2.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510000
川崎病是由感染因素引发的急性全身免疫性血管炎，其严重并发症为冠状动脉病变，尤其好发于5岁以下儿童，而川崎病引起的冠状动脉病变已成为部分国家和地区常见的后天性心脏病之一[1]，其发病率呈增高趋势[2-3]。过敏性紫癜也称IgA血管炎，是一种发生在儿童时期的系统性血管炎，其机制与免疫紊乱相关，以四肢对称性出血性皮疹为特征，常伴关节、消化道及肾脏等多系统器官损害[4]。两种疾病严重影响儿童的健康。目前川崎病和过敏性紫癜治疗尚缺乏针对性、统一性，尚无特效方法。
中医学认为，川崎病由小儿正气不足、邪气内伏引起，治疗上以温病卫气营血理论进行指导论治，治以清热、凉血等[5-6]。儿童过敏性紫癜病机为伏邪潜内、外因触发，应驱除邪气，治以清火解毒、化瘀通络[7]。血管炎发病由“伏火”引起，治以清火、降火、散瘀、化瘀等[8]。犀角地黄汤具有清热凉血散瘀的功效，用于各种出血、斑疹等免疫性血管炎如过敏性紫癜、川崎病等。本研究采用网络药理学方法探讨犀角地黄汤“异病同治”川崎病和过敏性紫癜的分子机制，为后续相关研究提供参考。
1.1 犀角地黄汤靶点收集
通过中药系统药理学数据库与分析平台[9]（TCMSP，https://www.tcmsp-e.com/tcmsp.php）以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18为条件进行筛选，检索牡丹皮、赤芍的活性成分，借助Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）转化为所对应的靶点名称；
生地黄、水牛角的活性成分根据已发表的文献[10-12]收集，从PubChem 数据库[13]（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取化学结构，通过Swiss ADME（http://www.swissadme.ch/）进行活性成分 筛 选 ， 使 用 SwissTargetPrediction （http://swisstargetprediction.ch/）进行靶点预测，得到犀角地黄汤活性成分及其作用靶点。
1.2 川崎病和过敏性紫癜靶点收集
通过GeneCards[14]（http://swisstargetprediction.ch/）、DrugBank[15]（https://go.drugbank.com/） 和OMIM[16]数据库（https://www.omim.org/）， 以“kawasaki disease” “Henoch-Schonlein purpura”“anaphylactoid purpura”“IgA vasculitis”为检索词检索疾病靶点，筛选得出基因靶点。
1.3 犀角地黄汤活性成分-川崎病和过敏性紫癜靶点蛋白相互作用网络构建
通过Venny2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）获取药物活性成分作用靶点和疾病靶点的交集靶点，并构建韦恩图，交集靶点通过STRING平台[17]（https://cn.string-db.org）构建蛋白相互作用（PPI）网络，将生物种类设定为“Homo sapiens”，最小相互作用阈值设定为＞0.9，得到PPI网络。将PPI网络信息导入Cytoscape3.7.2 软件中的MCODE 插件，对PPI 网络进一步分析，得到核心蛋白质功能模块，并对其分析总结。
1.4 靶点富集分析
将交集靶点录入Metascape 数据库[18]（http://metascape.org/gp/），将生物种类设定为“Homo sapiens”，分析方法选择“Custom Analysis”进行富集分析，如生物过程、细胞组分、分子功能及信号通路，总结与药物、疾病相关的核心分析结果，将数据通过微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）进行可视化展示。
1.5 活性成分-交集靶点-通路网络构建
将活性成分、交集靶点、通路共同建立网络数据库，导入Cytoscape3.7.2软件构建活性成分-交集靶点-通路网络，利用Network Analyzer对网络进行分析，根据网络连接度、介度、紧密度综合分析网络核心成分、主要靶点及核心通路。
1.6 分子对接验证
将活性成分-交集靶点网络中节点度值排名较前的核心靶点通过PDB 数据库[19]采集其结构然后利用PyMOL进行去水分子、去配体处理，AutoDock Tool进行加氢等处理，得到受体结构。网络中节点度值排名较前的活性成分结构通过PubChem 数据库收集，AutoDock Tool处理活性成分结构，得到配体。随后利用Autodock Tool实现分子对接，并将对接结果可视化及记录对接能量。
2.1 犀角地黄汤活性成分及成分靶点预测结果
通过TCMSP平台将筛选条件定为OB≥30%，DL≥0.18，检索牡丹皮、赤芍的活性成分，通过已发表的文献搜索生地黄、水牛角的活性成分，经筛选后收集到相应成分共19个，其中牡丹皮5个、赤芍10个、生地黄2个、水牛角2个，有3个为共有活性成分，见表1。
表1 犀角地黄汤主要活性成分
经活性成分配对靶点，其中牡丹皮靶点226个、赤芍靶点147个、生地黄靶点34个、水牛角靶点136个，经去除重复值，共获取306个靶点基因。
2.2 川崎病和过敏性紫癜靶点结果
通过GeneCards、DrugBank、OMIM数据库筛选去除重复值，获得川崎病潜在靶点1 416个，过敏性紫癜靶点1 093个。
2.3 蛋白相互作用网络构建
将筛选的犀角地黄汤活性成分靶点与川崎病和过敏性紫癜疾病靶点通过Venny2.1.0取交集靶点，并构建韦恩图，得到犀角地黄汤活性成分-川崎病和过敏性紫癜共同靶点71个，见图1。将交集靶点导入STRING数据库，将生物种类设定为“Homo sapiens”，最小相互作用阈值设定为＞0.9，得到PPI网络，见图2。其中核心靶点共66 个，网络平均连接度为7.333，介度0.023，紧密度0.431。
图1 犀角地黄汤活性成分-川崎病-过敏性紫癜交集靶点韦恩图
图2 犀角地黄汤治疗川崎病和过敏性紫癜靶点PPI网络
得到PPI 网络后，运用Cytoscape3.7.2 中的MCODE插件，通过分子复合物检测算法对相互作用关系进行分析，根据P值，保留PPI网络与模块中3个最佳评分的生物学进程对其进行功能描述，其中主要生物学功能为细胞因子受体结合，见表2。
表2 犀角地黄汤-川崎病-过敏性紫癜靶点PPI网络功能描述
2.4 GO和KEGG通路富集分析结果
借助Metascape 数据库对71 个交集靶点进行富集分析，GO 和KEGG 通路富集分析结果见图3。
图3 犀角地黄汤治疗川崎病和过敏性紫癜靶点富集分析
由结果可见，多个靶点的功能与川崎病和过敏性紫癜的发生密不可分。犀角地黄汤参与的生物学过程（BP） 有1 365 条，包括对脂多糖的反应（response to lipopolysaccharide）、对细菌来源分子的反应（response to molecule of bacterial origin）、炎症反应（inflammatory response）。细胞组分（CC）有51 条，分子功能（MF）有86 条。参与信号通路共161条，包括血管病变通路如流体剪切力；
炎症通路如TNF信号通路、IL-17信号通路、趋化因子信号通路；
补体和凝血级联反应等。相关靶点调节川崎病和过敏性紫癜的功能主要富集于细胞因子相关活性、细胞信号传递功能，受体配体活性等。
2.5 活性成分-交集靶点-通路网络构建结果
运用Cytoscape3.7.2构建犀角地黄汤活性成分-交集靶点-通路网络，节点106个，连接线525条，见图4。活性成分-交集靶点-通路网络分析结果：槲皮素连接度为60，介度为0.349 3，紧密度为0.633 5，预测槲皮素为犀角地黄汤治疗疗川崎病和过敏性紫癜的主要成分，其次为山柰酚（连接度为23，介度为0.048 9，紧密度为0.430 4）、黄芩素（连接度为13，介度为0.010 3，紧密度为0.396 9）。IL6在网络中的连接度为18，介度为0.037 6，紧密度为0.505 0，AKT1在网络中的连接度为18，介度为0.024 9，紧密度为0.500 0，预测IL6、AKT1为犀角地黄汤治疗川崎病和过敏性紫癜的主要靶点。根据2种疾病发病机制为炎症及免疫反应，病理变化为血管内皮损伤，TNF信号通路在网络中的连接度为20，介度为0.015 6，紧密度为0.423 2，流体剪切力在网络中的连接度为25，介度为0.034 9，紧密度为0.434 0，推断TNF信号通路及流体剪切力为核心信号通路。
图4 犀角地黄汤治疗川崎病和过敏性紫癜活性成分-交集靶点-通路网络
2.6 分子对接验证
根据活性成分-交集靶点-通路网络分析结果，槲皮素、山柰酚、黄芩素等为主要活性成分，IL6、AKT1等为核心靶点，通过分子对接，可得出槲皮素、山柰酚、黄芩素与IL6对接能量分别为-6.4、-6.3、-6.6 kcal/mol，槲皮素、山柰酚、黄芩素与AKT1 对接能量为-9.2、-9.2、-9.4 kcal/mol，说明活性成分与核心靶点结合活性较好，见表3，将对接能量以热图形式展示（见图5）。将槲皮素等配体与AKT1对接得到结构图，见图6。图中可以清晰显示氢键连接紧密。
图5 犀角地黄汤主要活性成分与核心靶点分子对接热图
图6 犀角地黄汤主要活性成分与AKT1对接模式
表3 犀角地黄汤主要活性成分与核心靶点分子对接结果（kcal/mol）
川崎病和过敏性紫癜均是与免疫反应相关的血管炎，可导致动脉瘤形成和肾脏损伤等[20]。研究表明，炎症介质、靶向黏膜屏障功能及IgA沉积引起的血管内皮因子病变与血管炎发生有关[21-24]。其治疗药物多为激素、免疫球蛋白等，可调节免疫、延缓疾病进展、降低复发率，但长期用药可能出现耐药，且存在药物不良反应，可能增加感染及肿瘤风险。
中医药治川崎病和过敏性紫癜均具有显著疗效。叶国华等[25]发现，犀角地黄汤可改善患者凝血指标和炎症反应，降低患者出血倾向。宋珂等[26-27]发现，犀角地黄汤可有效减轻过敏性紫癜患者临床症状及降低肾损伤的比例。刘旭和等[28]发现，犀角地黄汤加味可有效降低过敏性紫癜患儿复发率。基础研究表明，犀角地黄汤可减少促炎因子分泌、抑制炎症反应[29-30]。
根据网络药理学及分子对接结果可知，槲皮素、山柰酚、黄芩素是犀角地黄汤的主要活性成分，核心靶点主要是IL6、AKT1，信号通路主要有TNF信号通路、流体剪切力。川崎病及过敏性紫癜发病时会激活免疫细胞，产生多种细胞因子如IL6，而IL6又为核因子（NF）-κB靶点，可诱导其过度活化，进而产生多种炎症因子[31]，而TNF信号通路激活又会释放NF-κB，与IL6结合引发炎症反应，出现关节痛、红肿、肾损害等。AKT1激活增强血管内皮因子诱导的内皮屏障破坏[32]。同时，TNF信号通路激活产生炎症因子损伤血管内皮，从而发生血管炎。研究发现，流体剪切力是维持血管稳态的重要因素，流体剪切力谱改变是多种血管疾病的病理特征[33]，其机制是流体剪切力可抑制炎症介质对内皮细胞Smad2/3 的激活和EndMT 反应[34]，而2种疾病均可产生大量炎症介质，可破坏流体剪切力谱，从而产生血管病变，临床表现为紫癜、红斑等。槲皮素可抑制炎症小体分泌[35]，并可改变炎症代谢产物平衡、减轻炎症，克服炎症对血管内皮的有害影响[36]。山柰酚可起到保护血管免受氧化应激和炎症引起的损伤的作用[37]。黄芩素可预防血管的氧化应激和炎症损伤[38]。因此，犀角地黄汤可能通过减少IL6、AKT1生成及分泌，抑制TNF信号通路产生炎症因子，减轻内皮损伤，保护流体剪切力谱，防止血管病变，发挥治疗作用。
本研究基于网络药理学方法展示犀角地黄汤“异病同治”川崎病和过敏性紫癜内在机制，阐释犀角地黄汤具有保护血管内皮、抗炎、调节免疫等作用，进一步探究中药治疗这2种疾病的生物学功能及作用通路。
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