杨宗林 彭孟云 朱晓宁 汪 静※
（1.西南医科大学中西医结合学院，四川 泸州 646000；
2.西南医科大学附属中医医院肝胆病科，四川 泸州 646000）
原发性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第6 大最常见的癌症，是我国第4 位常见恶性肿瘤及第2 位肿瘤致死病因［1］。早期HCC 可选择手术、局部消融、肝动脉化疗栓塞等治疗，但术后易复发，5 年复发率高达70%［2］。因此，探索和发现有效的HCC 治疗策略仍然具有迫切性。丙型肝炎病毒（HCV）非结构5A蛋白（NS5A）反式激活基因13（HCV NS5A trans-regulated protein 13，NS5ATP13）是利用抑制性消减杂交技术发现的新基因［3］，研究［4］发现其可影响细胞的增殖、分化、rRNA 转录等，与肿瘤进展密切相关。和枢消积方是西南医科大学附属中医医院汪静教授多年来治疗HCC 的经验方。在长期临床中我们发现，该方能显著减缓肝癌的进展、提高患者生存率。然而其治疗HCC的机制尚不明确，推测其抗癌作用可能与调控NS5ATP13 有关，本研究采用和枢消积方作用于人肝癌细胞系HepG2，观察和枢消积方对HepG2 增殖凋亡的影响，并初步探究其分子机制，为和枢消积方治疗HCC提供理论依据。
1.1 材料
1.1.1 细胞株人肝癌细胞系HepG2，由赛百慷（上海）生物技术股份有限公司提供。
1.1.2 实验药物和枢消积方（由柴胡、黄芩、黄芪、鸡内金、生麦芽、醋鳖甲等组成）由西南医科大学附属中医医院药剂科提供。将所有饮片混匀，2500 mL 蒸馏水浸泡30 min，煎煮30 min，收集药液，药渣再加1000 mL蒸馏水煎煮30 min，合并2次药液，浓缩至含原药材1.5 g∕mL，0.22 μm微孔滤器过滤除菌备用。
1.1.3 实验试剂Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒购自日本同仁化学公司；
BCA 蛋白浓度测定试剂盒（增强型）购自上海碧云天生物技术有限公司；
B 淋巴细胞瘤-2 基因（BCL-2）、BCL-2 相关X 蛋白（BAX）、糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）、磷酸（p）-GSK-3β 单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology 公司，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、蛋白激酶B（AKT）、p-AKT、雷帕霉素靶蛋白（MTOR）、p-MTOR、NS5ATP13 单克隆抗体购自美国加州Santa Cruz公司。
1.2 研究方法
1.2.1 CCK-8法检测各组细胞活力及药物浓度筛选将HepG2 细胞接种于96 孔板，加入不同浓度和枢消积方（0 μg∕mL、 3.75 μg∕mL、 7.50 μg∕mL、 15.00 μg∕mL、30.00 μg∕mL、60.00 μg∕mL）干预24 h，配制CCK-8工作液，每孔加入100 μL 工作液，37 ℃孵育1 h，用酶标仪检测450 nm 的吸光度（A） 值。
细胞活力=（A加药-A空白）∕（A对照-A空白）×100%，细胞增殖抑制率=（A对照孔-A实验孔）∕（A对照孔-A空白孔）×100%。以半数抑制浓度（IC50）为最佳药物浓度，设为高剂量组，并根据高剂量组浓度的1∕4 及1∕2 设置低剂量组及中剂量组（分别为7.50 μg∕mL、15.00 μg∕mL、30.00 μg∕mL）。分别检测不同浓度和枢消积方干预HepG2 细胞24 h、48 h、72 h后的光密度（OD）值，计算相对应的细胞活力及增殖抑制率。
1.2.2 平板克隆实验检测各组细胞增殖能力将HepG2细胞以500 个∕孔接种于6 孔板中，按实验分组分别加入低、中、高剂量和枢消积方药液干预，37 ℃，5%CO2细胞培养箱中培养24 h后换用完全培养基继续培养，每2 d更换培养基，出现肉眼可见的克隆时，终止培养。磷酸盐缓冲液（PBS）清洗、甲醛固定、结晶紫染色，观察细胞克隆数，拍照记录。
1.2.3 蛋白质印迹法（Western Blot）使用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度。99 ℃，10 min 加热变性后，进行聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳1.5 h 后将蛋白质转印至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，封闭、孵育一抗、二抗，曝光显色并保存图像。
1.3 统计学方法采用SPSS 22.0 软件及GraphPad Prism Version 8.0.2 进行分析。计量资料以（±s）表示，组间比较用配对样本t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 和枢消积方对人肝癌细胞系HepG2细胞活性的影响与对照组相比，随着和枢消积方浓度的增加，HepG2细胞活性逐渐降低，当和枢消积方浓度≥7.50 μg∕mL 时，差异有统计学意义（P＜0.01）；
当和枢消积方浓度为30.00 μg∕mL时，IC50约为50%，故本实验选用7.50 μg∕mL、15.00 μg∕mL、30.00 μg∕mL 分别作为低、中、高剂量组进行后续实验。见图1。
图1 不同浓度和枢消积方对HepG2细胞活性及抑制率的影响
采用CCK-8 法检测低、中、高剂量组和枢消积方干预HepG2 细胞24 h、48 h、72 h 后的细胞活力。结果显示，与对照组相比，各组和枢消积方作用于HepG2 细胞48 h和72 h后均可显著降低HepG2细胞活力（P＜0.01），该作用呈剂量依赖性；
但在24 h 时仅高剂量表现出对细胞活力的抑制（P＜0.01），低、中剂量组与对照组比较差异无统计学意义。见图2。
图2 和枢消积方干预24 h、48 h、72 h对HepG2细胞活性的影响
2.2 和枢消积方对人肝癌细胞系HepG2细胞增殖的影响与对照组相比，和枢消积方各剂量组均可降低HepG2 细胞的集落生成，以高剂量最为明显，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图3。
图3 平板克隆实验检测和枢消积方对HepG2细胞增殖的影响
2.3 和枢消积方对人肝癌细胞系HepG2细胞BCL-2、BAX的影响与对照组相比，Western Blot显示各组和枢消积方均可促进BCL-2 蛋白表达降低、BAX 蛋白表达升高。见图4。
图4 和枢消积方对BCL-2、BAX蛋白的表达的影响
2.4 和枢消积方对NS5ATP13及AKT/GSK/MTOR信号转导通路的影响与对照组相比，各组和枢消积方均可显著降低NS5ATP13 蛋白表达，其中高剂量组最明显（P＜0.05）。与对照组相比，仅高剂量组和枢消积方使AKT、GSK、MTOR 蛋白表达下调，但差异无统计学意义（P＞0.05）。但相较于低剂量组，中、高剂量组和枢消积方可显著降低AKT、GSK、MTOR 蛋白表达（P＜0.05），呈剂量依赖性。与对照组相比，和枢消积方中、高剂量组均可使p-AKT、p-GSK、p-MTOR 蛋白表达降低（P＜0.05），而低剂量组降低不明显，可能与浓度过低有关。见图5。
图5 和枢消积方对NS5ATP13及AKT/GSK/MTOR 信号通路的影响
肝癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率一直居高不下，近10年针对HCC的诊断、治疗有了很大进展，但晚期HCC 患者5 年生存率仍很低［5］。中医药在肝癌治疗中有独特的优势，强调从整体出发，辨证论治，充分调动机体的防御功能，可以改善患者临床症状，减轻手术及分子靶向、生物免疫治疗等的不良反应，在临床中有着重要作用［6］。和枢消积方是西南医科大学附属中医医院汪静教授多年来治疗HCC 的经验方，该方主要由柴胡、黄芩、黄芪、鸡内金、生麦芽、醋鳖甲等组成，方中柴胡、黄芩，取小柴胡汤之意，行调和少阳枢机之功，辅以健脾益气、活血化瘀、软坚散结之品，诸药合用，使气机调畅、肝胃调和、脾气得健、癥积自消。在本研究中，我们采用不同浓度的和枢消积方作用于HepG2细胞，通过CCK-8法、平板克隆实验证明和枢消积方可抑制HepG2 细胞的增殖能力，呈浓度依赖性。
细胞凋亡在肿瘤的发生发展中起着重要作用，其中线粒体介导的内源性凋亡通路是调控细胞凋亡的中心，主要通过调节BCL-2 蛋白家族来发挥调节功能，BCL-2和BAX 是其中的重要分子，二者共同影响线粒体功能并调节线粒体释放凋亡激活因子来调控细胞凋亡［7］。本研究通过Western Blot显示和枢消积方可抑制BCL-2、上调BAX 的蛋白表达，推测和枢消积方可通过调控线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡。
磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）∕AKT 信号通路是人类癌症中被激活最常见的信号通路，在细胞周期调控、细胞增殖分化、蛋白质合成和葡萄糖代谢活动起重要作用，研究［8］显示其在肝癌的发展中起到关键作用。AKT是PI3K信号通路的重要效应器，磷酸化的AKT参与细胞增殖、代谢、存活和运动等多项细胞活动［9］。GSK-3 是一种丝氨酸∕苏氨酸蛋白激酶，通过多种途径调节细胞的增殖、分化［10］，活化的AKT 可以抑制GSK-3β 的活性［11］，发挥抑癌作用，是治疗肝癌的潜在靶点。MTOR是细胞代谢的重要调节点，磷酸化的AKT 可直接使MTOR 活化，促进蛋白质的生物合成、诱导细胞增殖，同时增加对细胞凋亡的抑制，促进肿瘤进展［12］。NS5ATP13是新发现的基因，研究显示［13］其与肝癌、食管癌、肾癌等进展密切相关，是治疗肿瘤的潜在靶点。前期研究［14］显示降低NS5ATP13 可抑制AKT∕GSK∕MTOR 信号通路活化，从而抑制HepG2 细胞增殖并诱导细胞凋亡。
在本研究中，我们发现和枢消积方可抑制p-AKT、p-GSK、p-MTOR及NS5ATP13的蛋白表达，推测和枢消积方可能通过抑制NS5ATP13 来抑制AKT∕GSK∕MTOR 信号转导通路的活化，进而抑制HepG2 细胞的增殖并诱导细胞凋亡，发挥抗癌作用。
综上所述，本研究证明了和枢消积方可以抑制HepG2 细胞的增殖，并诱导其凋亡。其机制可能与和枢消积方抑制NS5ATP13 正反馈AKT∕GSK∕MTOR 信号通路有关。
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