祁彩虹,李 丽,廖 璞△
1.西南医科大学临床医学院检验科,四川泸州 646000;2.重庆市人民医院检验科,重庆 401147
骨质疏松症(OP)是因骨组织质量和密度减少,从而导致骨骼脆弱易碎的一种普遍存在的骨骼疾病[1]。随着人口老龄化进程加剧,OP已成为全球流行病之一,其发病率仅次于心血管疾病和糖尿病,在慢性病中排名第3位。2018年国家卫生健康委员会发布的首个我国OP流行病学调查结果显示,我国50岁以上人群的OP患病率为19.2%,而65岁以上人群的患病率高达32.0%[2]。据世界卫生组织预测,到2050年我国骨质疏松性骨折患者将达600万例,相应的医疗费用将达254亿美元/年[3]。我国每年有数百万人因OP导致骨折,其中约1/5的患者因骨折并发症而死亡,约一半的存活者会面临不同程度的残疾,这给家庭和社会带来了沉重的负担[2,4]。因此,为了提高OP患者生活质量,早期诊断必不可少。
目前,OP的诊断常通过测量骨密度并结合患者的家族史和临床症状来进行综合评估[5-6]。外泌体微小RNA(miRNA)是一类具有基因表达调控功能的小分子RNA,通过调控多种生物学过程,在靶细胞内发挥作用[7]。外泌体miRNAs可以通过调节OP患者骨细胞的增殖、分化、凋亡等过程来调控骨形成与骨吸收的平衡,从而影响骨组织的代谢和再生。研究发现,与OP相关的外泌体miRNAs在血液、尿液和骨髓液等体液中的表达水平发生了变化,表明其在OP的早期诊断、治疗监测及预后判断中可能作为潜在的生物标志物[8-9]。近年来,越来越多的研究强调了外泌体miRNAs可能成为OP的生物学标志物,在OP患者早期诊断中发挥重要作用[10-12]。本研究从OP患者的血清中提取外泌体,检测其中miRNA-21和miRNA-214的表达水平,进一步分析二者在OP临床诊断中的应用价值,为OP的早期诊断提供依据。现报道如下。
1.1一般资料 选取2022年1月至2023年12月重庆市人民医院收治的OP患者为研究对象。纳入标准：(1)骨密度测量结果显示骨量减少;(2)具有特定类型的骨折史;(3)常出现骨痛、身高减少和脊柱弯曲等症状。排除标准：(1)可能导致OP样表现的其他骨病,如骨肿瘤、骨髓炎等;(2)使用可能导致OP的激素类药物;(3)合并其他可能与OP有关的疾病,如甲状旁腺功能亢进等。共纳入OP组77例,其中男35例、女42例,平均年龄(71.08±10.54)岁。另选取同期在重庆市人民医院体检中心体检的81例健康者为对照组,其中男38例、女43例,平均年龄(69.96±8.77)岁。两组性别、年龄比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。所有研究对象均知晓本研究,并签署知情同意书。本研究获重庆市人民医院医学伦理委员会批准(编号：S2020-200-01;S2021-065-01)。
1.2仪器与试剂 外泌体提取试剂盒由江苏凯基生物技术股份有限公司提供;miRNA提取试剂盒由杭州倍沃医学科技有限公司提供;miRNA第一链cDNA合成(加尾法)试剂盒由生工生物工程(上海)股份有限公司提供;BlasTaq 2×qPCR MasterMix试剂由Applied Biological Materials提供;伯乐CFX96实时荧光定量PCR仪;JEM-1200EX透射电子显微镜(BTEM技术)购自日本电子株式会社;PMX110纳米颗粒跟踪分析仪(NTA技术)购自德国Particle Metrix公司。
1.3方法
1.3.1血清外泌体提取及鉴定 收集所有研究对象的血清,按照试剂盒说明书操作步骤提取血清外泌体,将得到的纳米级囊泡复溶在300 μL磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L,pH值7.4)中,保存于-80 ℃环境中。所有样品的处理和离心都在冰上进行。采用生物透射电镜和NTA技术表征外泌体的形态和大小[8,10],采用蛋白质印迹法(WB)检测外泌体标志物CD63的表达。
1.3.2血清外泌体miRNA-21和miRNA-214提取及检测 按miRNA提取试剂盒说明书,从外泌体中提取miRNA,然后进行实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)。用miRNA第一链cDNA合成试剂盒进行反转录,得到cDNA。随后用BlasTaq 2× qPCR MasterMix试剂对cDNA进行扩增,反应条件：95 ℃ 3 min预变性,95 ℃ 1 s变性,60 ℃ 10 s退火延伸,40个循环进行扩增,每个样品重复3次。用2-ΔΔCt计算miRNA-21和miRNA-214的相对表达水平。
2.1血清外泌体的鉴定 采用BTEM和NTA技术表征OP患者血清外泌体。如图1A和图1B所示,外泌体的大小不一,呈现出类似圆形或椭圆形的双层脂质膜囊泡,直径为25～265 nm,中位粒径为105 nm。采用WB鉴定血清外泌体特异性蛋白表达,结果显示,血清外泌体中CD63标志蛋白呈高表达(图1C)。
注：A为BTEM表征外泌体的形态;B为NTA技术追踪外泌体大小;C为WB鉴别外泌体特征蛋白CD63的表达。
2.2两组血清外泌体miRNA-21、miRNA-214表达水平比较 OP组血清外泌体miRNA-21和miRNA-214相对表达水平明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。
表1 两组血清外泌体miRNA-21、miRNA-214表达水平比较[M(P25,P75)]
2.3miRNA-21、miRNA-214影响OP发生的Logistic回归分析 以是否患OP为因变量(赋值：是=1,否=0),以miRNA-21、miRNA-214的相对表达水平为自变量(赋值：均为原值输入),进行多因素Logistic回归分析。结果显示,miRNA-21、miRNA-214相对表达水平升高是导致OP发生的危险因素(P<0.05)。见表2。
表2 miRNA-21、miRNA-214影响OP发生的Logistic回归分析
2.4血清外泌体miRNA-21、miRNA-214单独及联合检测对OP的诊断效能分析 根据多因素Logistic回归分析得到血清外泌体miRNA-21、miRNA-214联合检测诊断模型,即Y=-3.326+0.624×XmiRNA-21+ 0.756×XmiRNA-214。以对照组为阴性样本,OP患者为阳性样本,绘制ROC曲线。结果显示,血清外泌体miRNA-21、miRNA-214联合检测诊断OP的灵敏度为90.9%,特异度为84.0%,AUC为0.919,高于miRNA-21、miRNA-214单独检测的AUC(0.853、0.811),差异均有统计学意义(Z=-3.079,P<0.05;Z=-3.518,P<0.001)。见表3、图2。
表3 血清外泌体miRNA-21、miRNA-214单独及联合检测诊断OP的效能分析
图2 血清外泌体miRNA-21、miRNA-214单独及联合检测诊断OP的ROC曲线
OP在全球范围内分布广泛,其发病率随着人口老龄化趋势的加剧而上升。流行病学研究表明,OP对中老年人(特别是女性)的身体健康影响较大。女性绝经期后由于雌激素水平降低,患OP的风险明显增加[1,13]。此外,一些慢性疾病、遗传因素、不良生活方式和营养不良也与OP的发生、发展密切相关。OP使骨骼(特别是脊椎、髋部和腕部)易发生骨折,不仅会导致疼痛和功能障碍,还可能引发残疾等严重的健康问题,导致生活质量下降[2-3]。总体而言,对患者的健康和生活质量造成重大影响的OP是一个严重的公共卫生问题。预防、早期诊断和综合治疗是控制OP的关键策略,可以减少骨折风险并提高患者的生活质量[4]。
目前,OP的诊断多以影像学检查并辅以实验室检查而确诊,然而,实验室诊断缺乏早期诊断指标,且特异度不高、灵敏度也较低,影像学诊断在出现结构改变时才能发现,这些改变往往不可逆,不利于患者的预后[14]。
miRNAs是一类内源性非编码小分子(长度通常为19～25个核苷酸)单链RNA,广泛存在于真核生物中,高度保守,通过与靶基因mRNA的互补序列(3′非翻译区、5′非翻译区、编码区)结合,在转录后水平调节基因表达[15]。miRNAs参与疾病的起源和发展,并具有病理特异性,因此可作为疾病早期检测的生物标志物[16]。
外泌体是一种细胞主动分泌的纳米囊泡(直径30～150 nm),具有脂质双分子层结构,内含多种核苷酸(如DNA、miRNA、LncRNA等)、特异性蛋白和脂类等遗传物质[17]。研究表明,外泌体可作为遗传信息的传递者参与多种疾病的发生、发展,通过携带和传递信号分子到细胞,从而调节细胞的病理和生理状态[17-18]。在许多生物过程中,细胞将miRNAs包裹在外泌体内,通过外泌体释放到外周循环,从而靶向调控受体细胞中靶mRNA的翻译。研究发现,外泌体的脂质双分子层结构可使其包裹的物质免受RNA酶及蛋白酶等的降解[19-20]。循环miRNAs被外泌体包裹后具有高度生物学稳定性,如血浆外泌体miRNA在4 ℃储存96 h或在-70 ℃下储存4周后,其表达谱仍无明显变化,且在-20 ℃以下保存5年仍能保持其数量的相对稳定,甚至在经过2次反复冻融后仍未受到明显影响[21]。因此,除生物学特性及靶向特异性外,外泌体的膜结构可增强miRNAs的稳定性,提高其作为OP早期诊断生物标志物的能力。
研究发现,在OP的发病机制中,外泌体miRNAs发挥了重要作用。SUN等[10]研究发现,破骨细胞能够分泌非常丰富的外泌体源性miRNAs,并验证了其在血液循环中不仅可以作为骨量丢失的生物标志物,还可选择性地调节成骨细胞的功能。LI等[8]研究发现,血清外泌体miR-214-3p水平升高与老年女性的骨折及去卵巢小鼠的骨形成减少密切相关,骨髓间充质干细胞成骨分化可被破骨细胞分泌的含有miR-214的外泌体囊泡抑制。MENG等[12]研究发现,miRNA-21通过靶向调控多个信号通路和基因表达,参与调节骨细胞增殖、分化和骨重建等过程,可抑制骨吸收,促进骨形成,从而对OP的发生和发展产生影响。miRNA-21和miRNA-214的异常表达可能导致骨细胞功能紊乱,破坏骨吸收与骨重建的平衡,从而导致OP的发生。说明骨组织细胞来源的外泌体miRNA-21和miRNA-214可能作为早期诊断的生物标志物,在OP的早期筛查及诊疗过程中蕴含巨大潜力和价值,临床应用前景广阔。
本研究结果表明,OP组血清外泌体miRNA-21和miRNA-214表达水平高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。除此之外,本研究还评估了miRNA-21和miRNA-214检测在OP诊断中的应用价值,结果显示,血清外泌体miRNA-21、miRNA-214联合检测诊断OP的灵敏度(90.9%)和特异度(84.0%)均较高,且二者联合诊断OP的AUC为0.919,高于各指标单独检测的AUC。表明血清外泌体miRNA-21和miRNA-214联合检测对OP患者和健康人群的识别更准确,可提高OP早期发现率。
综上所述,血清外泌体miRNA-21和miRNA-214表达水平升高是导致OP发生的危险因素,miRNA-21和miRNA-214单独检测对OP的诊断具有一定的价值,且二者联合检测可提高诊断的精确性。通过外泌体来源的miRNAs诊断OP,具有准确、快捷和无创等特点。但本研究样本量较少,可能会造成某种程度上研究结果的偏倚,因此存在一定的局限性。在本研究基础上,未来需要加大样本量,并开展多中心前瞻性研究,进一步验证该结论,从而为OP患者的早期诊断提供理论基础。
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