兰艳艳，杨 婷，黄秋玲，庞莉娜，陈小梅，王志福，俞向梅
（1.福建中医药大学附属康复医院，福建 福州 350003；
2.福建中医药大学康复医学院，福建 福州 350122；
3.重庆市中医院，重庆 400021；
4.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122）
糖尿病周围神经病变是糖尿病常见的严重微血管并发症，总体患病率约为26%，其中近1/3 患者出现糖尿病周围神经痛（diabetic neuropathic pain，DNP），临床主要表现为肢体远端感觉功能障碍，包括麻木、灼烧或刺痛，严重影响患者生活质量［1-3］。2018 年糖尿病周围神经病理性疼痛诊疗专家共识及2019年《Nature Reviews Disease Primers》报道明确指出，DNP 诱导的氧化应激发生是驱动脊髓背角痛觉敏化的关键机制［4-5］。
核因子E2 相关因子2（NF-E2 related factor 2，Nrf2）作为一种重要的转录因子，参与调控多种抗氧化基因的转录过程［6］。在慢性疼痛过程中，胞质Nrf2 从Keap1 释放进入细胞核，进而促进抗氧化应激基因（如HO-1、NQO1、SOD 和GCL 等）的转录［7-8］。研究表明，在DNP 发生时，脊髓背角Nrf2 表达显著降低，而通过应用白藜芦醇、筋骨草素二萜-1（ajugarin-1）等干预可显著提高DNP 脊髓背角Nrf2 表达，减轻氧化应激。综上所述，Nrf2的镇痛作用可通过减少脊髓背角氧化应激而发挥作用［9-10］。DNP 属中医学“消渴”“痹证”范畴。临床研究显示，电针足三里、肾俞等可显著降低糖尿病周围神经痛［11-14］。本项目组前期研究证实，电针能够显著抑制DNP脊髓背角氧化应激［15］，但是否与调控Nrf2 及相关基因表达，目前暂不清楚。
1.1实验动物 SPF 级SD 雄性大鼠共28 只，体质量（220±30）g，均由福建中医药大学实验动物中心［许可证号：SYXK（闽）2019-0007］购入，并饲养于SPF 级动物实验室，予以自由饮水和进食，保持适宜的温度、适度，并提供光照明暗交替以形成正常的昼夜节律。本研究通过福建中医药大学实验伦理委员会审批（审批号：FJTCM2019-006），动物实验严格遵循我国相关实验动物规定及本校实验动物中心的管理制度。
1.2主要试剂与耗材 链脲佐菌素（STZ，批号：S8050）、pH 4.5 0.1 mol/L柠檬酸缓冲液（批号：C1013）均购于北京索莱宝科技有限公司；
Neun 抗体（批号：66836-1-Ig）购买于武汉三鹰生物技术有限公司；
RNAs 提取试剂盒（批号：R223-01）购买于南京诺唯赞生物科技股份有限公司。PL-200 热刺痛仪购买于成都泰盟软件有限公司。0.25 mm×13 mm一次性无菌毫针、电子针疗仪（型号：SDZ-Ⅱ）均购买于苏州医疗用品有限公司。
2.1实验分组 28 只SPF 级SD 雄性大鼠按照随机数字法分别为对照组、模型组、电针组、Nrf2 干扰组，每组7 只。
2.2动物造模 参考文献［16］的模型复制方法，具体操作如下：造模前1 d，大鼠禁食8 h。腹腔注射STZ（溶解于pH 4.5 的0.1 mol/L柠檬酸缓冲液），剂量为60 mg/kg。注射后第1 周、第2 周，通过葡萄糖试纸测量大鼠尾静脉的空腹血糖水平，仅当大鼠连续2 次测量的空腹血糖值均＞16.7 mmol/L 时，认定糖尿病模型复制成功。结合前期研究，糖尿病大鼠的热痛潜伏期显著低于对照组的1/2，则将其纳入糖尿病周围神经痛模型进行实验［15］。
2.3脊髓鞘内注射 Nrf2 干扰组于造模前2 周鞘内注射Nrf2 病毒干扰剂［rAAV-U6-shRNA（rNfe22）-C），购买于购于布林凯斯（深圳）生物技术有限公司］。鞘内注射方法参考团队前期研究［17］，具体步骤如下：异氟烷快速麻醉，并使大鼠俯卧于操作台上，充分暴露L4～L5椎间隙腰椎。确定注射位置并消毒后，使用27G 微量注射器垂直脊柱，缓慢倾斜45°并滑入关节间隙。感知落空感后固定针柄，以2 μL/min 速度缓慢注射，总注入20 μL/只，缓慢拔出注射器。
2.4干预方法 电针组、Nrf2 干扰组在造模2 周后开始进行干预，隔日电针1次，每周3次，共电针4周。具体操作如下：将大鼠固定在专用固定架上，参照《实用腕踝针疗法》［18］选取大鼠双侧“足三里”与“肾俞”穴，0.25 mm×13 mm一次性无菌毫针以5 mm的深度刺入，电针参数为10 Hz 频率、0.5 mA 电流，连续波，每次30 min［19-20］。对照组和模型组进行相同的固定操作，但不进行电针干预。干预结束后，将所有大鼠放回各自的笼内饲养。
2.5标本取材及制备 样本分为新鲜蛋白组织和多聚甲醛固定病理切片2 类。末次热痛潜伏期测量后，各组随机抽取4 只大鼠，断头处死大鼠，低温快速取出大鼠脊髓背角新鲜组织，液氮速冻后及时存放于-80 ℃冰箱中；
各组取3 只大鼠经心灌注固定，选取大鼠脊髓进行多聚甲醛固定制作冰冻切片。
2.6观察指标及检测方法
2.6.1足底热痛潜伏期 采用PL-200 热刺痛仪测量，操作参考文献［21］具体如下：将大鼠放入15 cm×15 cm×15 cm 的有机玻璃箱中适应15 min。然后，将仪器的光源对准大鼠足掌，光源强度设定为30%。设定自动切断时间为30 s，按下开关后，记录大鼠抬足或舔足的时间。每只大鼠分别在造模前、造模后2 周、造模后6 周进行测量，每次间隔至少5 min。为避免足底受伤，保持检测时间段一致，减少昼夜节律对疼痛阈值的影响。
2.6.2免疫荧光法检测4 组大鼠脊髓背角Nrf2 与Neun 共定位情况 4 组大鼠脊髓背角冰冻切片，通过蛋白酶K 消化后添加Nrf2 原位杂交探针进行过夜杂交，利用SSC 溶液洗涤去除非特异性结合，接着进行免疫荧光，先后孵育一抗和二抗以标记Neun，使用DAPI 进行核染色，最后在荧光显微镜下观察。
2.6.3qPCR 检测4 组大鼠Nrf2 及其相关基因mRNA 和调控基因miRNA 的相对表达水平 取出4 组脊髓背角新鲜组织匀浆离心，每管加入1 mL RNA Isolator，提取RNA 样本根据试剂盒逆转录合成cDNA。根据mRNA、miRNA 序列，按照相应的种属选取GAPDH、U6 作为内参基因；
采用qPCR 技术以及2-ΔΔCT法计算上述基因相对表达水平。引物序列见表1。
表1 引物序列
2.7统计学方法 采用SPSS 22.0 统计学软件分析。计量资料符合正态分布采用（±s）表示，组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t法，重复测量数据采用重复测量方差分析。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。
3.14 组大鼠足底热痛潜伏期比较 见表2。
表2 4 组大鼠足底热痛潜伏期比较（±s）s
表2 4 组大鼠足底热痛潜伏期比较（±s）s
注：与对照组比较，1） P＜0.05；
与模型组比较，2） P＜0.05；
与电针组比较，3） P＜0.05。
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3.24 组大鼠脊髓背角Nrf2 与神经元标记物NeuN共定位比较 对照组大鼠脊髓背角Nrf2 与神经元标记物NeuN 存在大量共表达，提示Nrf2 大量表达在脊髓背角神经元上；
模型组大鼠脊髓背角提示神经元上Nrf2 显著降低；
电针组大鼠经肾俞、足三里电针干预后神经元上Nrf2 表达显著升高；
Nrf2 干扰组大鼠经电针后，Nrf2仍处于低水平表达。见图1。
图1 4 组脊髓背角Nrf2 在神经元上的表达情况
3.34 组大鼠脊髓背角Nrf2、Keap1、NQO1、HO-1、Catalase mRNA 相对表达水平比较 见表3。
表3 4 组脊髓背角Nrf2、Keap1、NQO1、HO-1、Catalase mRNA 相对表达水平比较（±s）
表3 4 组脊髓背角Nrf2、Keap1、NQO1、HO-1、Catalase mRNA 相对表达水平比较（±s）
注：与对照组比较，1） P＜0.05；
与模型组比较，2） P＜0.05；
与电针组比较，3） P＜0.05。
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3.44 组大鼠脊髓背角miRNA 相对表达水平比较 见表4。
表4 4 组小鼠脊髓背角miR-144-3p、miR-155-5p、miR-17-5p、miR-497-5P 相对表达水平比较（±s）
表4 4 组小鼠脊髓背角miR-144-3p、miR-155-5p、miR-17-5p、miR-497-5P 相对表达水平比较（±s）
注：与对照组比较，1） P＜0.05；
与模型组比较，2） P＜0.05；
与电针组比较，3） P＜0.05。
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糖尿病周围神经痛（DNP）是糖尿病最常见的并发症之一，临床表现为肢体刺痛，属中医学“痹证”范畴。根据痹症所在部位，取相应脏腑的腧穴或合穴治疗作为针灸治疗痹证的康复原则，取穴主要有肾俞、足三里等。足三里为足阳明经之要穴，具有活血通络、除痹止痛的功效，可有效改善DNP症候。晋代·皇甫谧《针灸甲乙经》载：“消渴身热……阴气不足，热中消谷善饥……足三里主之。”《灵枢》载：“着痹不去，久寒不已，卒取其三里骨为干”，可治下肢痿痹不遂［22］。肾俞穴为肾中经气输注的部位，具有滋补肾阴作用，可有效控制血糖水平，调节血脂，并调整微血管病变［23］。《千金方》言：“消渴小便数……又灸背上脾俞下四十、肾俞两处。”研究证实，电针足三里、肾俞等穴可明显改善DPN痛觉过敏，如减轻脊髓背角氧化应激，改善周围神经感觉和运动传导速度（SNCV、MNCV）［24-26］。
DNP 中枢敏化与脊髓背角氧化应激密切相关，Nrf2 作为一种重要的转录因子，参与调控多种抗氧化基因转录过程。研究证实，在DNP 发生时，脊髓背角Nrf2 表达显著降低，应用中药及有效成分可显著提高DNP 脊髓背角Nrf2 表达，调控氧化应激基因转录，降低痛敏反应［9-10］。本实验研究表明，电针治疗可显著提高脊髓背角Nrf2 表达，降低Keap1 释放，提高如NQO1、HO-1、Catalase mRNA 相对表达水平，提示电针可能通过解除Nrf2 与Keap1 结合，促进Nrf2 核内转录，从而促进抗氧化应激相关因子如NQO1、HO-1、Catalase 的表达，减轻疼痛反应。通过鞘内注射Nrf2 表达干扰病毒，可逆转电针的镇痛效果，进一步验证电针可能通过脊髓背角Nrf2/Keap1 抗氧化应激途径，减轻DNP 热痛觉过敏反应，深层的机制有待今后进一步研究。
miRNA 是一类非编码RNA，参与转录后基因调控，研究其功能及表达有助于更好地了解疾病发生与干预的分子作用机制。研究表明，miRNA 在糖尿病及其相关并发症中扮演着关键角色。miR-497 通过抑制USP15，参与调控糖尿病神经性疼痛的进程，显示出潜在的治疗作用［27］。同时，环境内分泌干扰物DEHP 诱导的胰岛素抵抗中，miR-17 和miR-200a 通过影响胰岛素信号传递的关键环节，展现了调控胰岛素抵抗的复杂机制［28］。此外，锌暴露与2 型糖尿病（T2DM）的发展密切相关，其中miR-144-3p 通过影响Nrf2 和抗氧化酶表达，参与锌诱导的胰岛素抵抗，进一步揭示了miRNA 在糖尿病发展中的多重作用机制［29］。本研究实验结果表明，DPN 发生时脊髓背角miR-144-3p 显著上调，电针可显著逆转miR-144-3p 过表达，而鞘内注射Nrf2 受体病毒干扰降低电针效应。但miR-155-5p、miR-17-5p 和miR-497-5P 在电针干预DPN 模型中没有显示出显著差异。
综上所述，电针足三里、肾俞可能通过调节脊髓背角Nrf2/Keap1 氧化应激重要通路，提高Nrf2 表达，降低Keap1 含量，升高NQO1、HO-1、Catalase 基因相对表达水平，并减少Nrf2 密切相关基因miR-144-3p 表达，从而提高糖尿病神经痛大鼠热痛潜伏期，减轻痛敏反应。
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