王德瑞，吴佳俐，张洪霞，宋宛霖，汪 辉，冯大伟
(1.中国科学院烟台海岸带研究所，山东烟台 264003；
2.中国农业大学资源与环境学院，北京 100193；
3.烟台大学生命科学学院，山东烟台 264003；
4.中国科学院青岛生物能源与过程研究所，山东青岛 266101)
我国是水产养殖大国，2020 年全国海水养殖牡蛎产量达542.46×104t，占海水贝类养殖产量的36.65%[1]。然而，我国对贝类资源的利用通常局限于贝肉，对于质量占比超过80%的贝壳利用措施并不系统、完善[2]。大量被丢弃的牡蛎壳不仅占用大面积土地，造成严重环境污染，同时也浪费了大量碳酸钙资源[3]。近年来，将经过处理的牡蛎壳粉作为土壤改良剂的研究越来越多。赵丽芳等[4]研究表明牡蛎壳粉经过高温煅烧后碱性增强，可以有效中和土壤中的H+，改良酸性土壤，提高土壤磷酸酶活性，增加土壤有效磷含量，改善作物生长状况。姬佳旗[5]发现将牡蛎壳粉施入酸性土壤可以有效改善土壤酸化状况，提高微生物丰富度，实现对烟草青枯病的有效防控。黄玉珍等[6]将牡蛎壳粉做成土壤调理剂后应用到晚籼稻栽培中，发现牡蛎壳粉可以显著提高作物的抗倒伏能力。
堆肥是对废弃物进行资源化利用最常用的方法，具有成本较低、操作简单、周期短等特点[7]。LEE,et al[8]发现将牡蛎壳粉与有机废弃物共同进行堆肥处理，通过堆肥过程中的高温以及微生物的作用，可以改变牡蛎壳粉的结构，促进钙的活化。LU Mingyi,et al[9]研究表明牡蛎壳的添加也可以减少堆肥中氨气的排放，提高堆肥质量。氮源是发酵的核心因素，其来源不同将对发酵结果产生重要影响[10]。牡蛎壳中氮含量极少，为了达到较好的发酵条件需要额外添加氮源，而目前对堆肥处理牡蛎壳的氮源选择方面研究较少。因此，本研究利用堆肥技术对牡蛎壳进行处理，选择豆粕和尿素2 种氮源，探究不同氮源对糖渣堆肥处理牡蛎壳过程和堆肥产品腐熟度的影响，研究堆肥处理牡蛎壳的可行性，为牡蛎壳的资源化利用提供更多理论依据和技术支持。
1.1 试验材料
发酵试验原料包括：牡蛎壳粉(由山东地宝土壤修复科技有限公司提供)、糖渣(购自滨州市京阳生物肥业有限公司)、豆粕(购自烟台宝聚海藻有限公司)和尿素(由众德肥料有限公司提供)。各物料的基本理化性质见表1。
表1 试验材料理化性质Tab.1 Physicochemical properties of materials
1.2 堆肥装置
堆肥试验装置见图1，堆肥试验在55 ℃恒温培养箱中进行，反应器为带橡胶塞的5 L 玻璃瓶。将玻璃瓶放于培养箱底部架子上，防止底部过热。反应器盖子上分别设有进气口、出气口以及电子温度计孔，进气口与气泵进行连接，对反应器进行连续强制通风，以保证整个堆肥过程处于好氧状态，每个反应器通风量由转子流量计控制，调节进气量为0.2 L·min-1。出气口连接装有100 mL 浓度为2%硼酸溶液吸收瓶，以吸收堆肥过程中产生的氨气。另在反应器的塞子上插有一支电子温度计，以便于每天记录堆体温度。
图1 堆肥装置示意图Fig.1 Sketch map of composting reactor
1.3 试验设计
试验在中国科学院烟台海岸带研究所植物化学与产品工程试验室进行。对照组(CK)将糖渣与豆粕按照一定比例混合，不添加牡蛎壳；
DP 组在对照组的基础上添加20%牡蛎壳粉(以干重计)；
NS 组将糖渣与尿素按照一定比例混合，并添加20%牡蛎壳粉(以干重计)。调节所有处理的C/N=25，初始含水率在65%左右。将物料充分混合后，装入反应器，发酵时间持续35 d，所有处理组的通风条件相同。在第0、3、6、9、14、21、28、35 天将物料取出进行翻堆，充分混合后用多点取样法收集样品。样品分2 份保存，一份鲜样存于4 ℃冰箱，用于测定pH、电导率(electrical conductivity,EC)和发芽指数(germination index,GI)等指标，另一份风干后用于测定有机物含量(OM)、腐殖酸、不同形态钙含量及红外光谱分析。
1.4 指标测定
每天用电子温度计测定堆体温度。NH3采用2%硼酸溶液吸收，标准稀硫酸溶液滴定的方法测定。鲜样的浸提液(w：v=1：10)用于测定pH、EC 和GI。GI 测定在培养皿中进行。每个培养皿中加入5 mL 浸提液，放入10 粒小麦种子，室温下避光培养48 h 后测定。总腐殖酸(humus acid,HS)、胡敏酸(humic acid,HA)和富里酸(fulvic acid,FA)用0.1 mol·L-1Na4P2O7·10H2O 和0.1 mol·L-1NaOH 混合液萃取，然后利用TOC 分析仪进行测定。用傅里叶红外光谱仪(Nicolet iS50，Thermo Fisher Scientific，美国)分析样品中的官能团变化。水溶态和交换态Ca2+分别利用蒸馏水和1 mol·L-1乙酸铵提取，用电感耦合等离子体质谱仪(ELAN DRC II，PerkinElmer(Hong Kong)Ltd.)进行测定。
2.1 理化指标变化
2.1.1 堆体温度变化温度是反映好氧发酵过程中微生物活性和有机物降解的重要指标[11]。由于微生物的代谢和繁殖使得大量有机物在堆肥初期被降解并释放了能量[12]，温度迅速上升。如图2 所示，所有处理在第1 天进入高温期(＞55.0 ℃)，CK 组在第1 天达到最高温度69.1 ℃，DP 组和NS 组在第3 天达到最高温度66.1 ℃和61.4 ℃。CK、DP 和NS 处理温度高于60.0 ℃的天数分别为16、10 和3 d。此后随着易降解有机物逐渐被分解，各处理的温度逐渐下降，22 d 后各处理逐渐稳定在53.0 ℃左右。DP 组和NS 组温度在堆肥过程中低于对照组，可能是因为牡蛎壳的添加降低了堆体有机物的占比，使产生的热量相对较少。
图2 堆肥过程中的温度变化Fig.2 Changes in Temperature of piles during composting
2.1.2 pH 和电导率
所有处理的pH 变化见图3(a)。CK、DP 和NS 组的初始pH 分别为6.10、7.23 和7.15。由于牡蛎壳粉呈碱性，所以DP 组和NS 组初始pH 高于CK 组。CK 组和NS 组pH 在第3 天达到第一个峰值，分别为8.92和9.34；
在第9 天达到第二个峰值，分别为8.98 和9.28。DP 组在第6 天达到峰值9.47，此后各处理pH 均呈现下降趋势。堆肥结束后所有处理的pH 降低，在6.79～7.94 之间，符合有机肥料标准NY/T525-2021 规定(5.5～8.5)，这说明牡蛎壳粉对pH 没有不良影响，最终发酵产品也达到成熟要求[13]。
图3 堆肥过程中的pH(a)和EC(b)变化Fig.3 Changes in pH (a) and EC (b) of piles during composting
电导率(EC)表示发酵体系中可溶性盐离子的含量，可以反映发酵成熟度和植物生长受到毒害程度[14]。各处理的EC 值变化见图3(b)。各处理初始EC 值在0.91～1.33 mS·cm-1之间，第3 天各处理的EC 值有所增加，此后呈现先降低后升高的趋势。堆肥过程中DP组EC 最小值为1.14 mS·cm-1出现在第9天，CK 组和NS 组最小值分别为0.79 和1.13 mS·cm-1，出现在第14 天。堆肥结束后所有处理的EC 值处于1.86～2.53 mS·cm-1之间。
2.1.3 堆肥过程中的NH3变化
在好氧发酵过程中，NH3的排放是造成氮素损失的最主要原因，同时，由于发酵过程中有机氮的矿化而导致的NH3排放可能会造成最终发酵产物的质量下降以及臭气问题[15-16]。堆肥过程中的NH3日变化见图4(a)，所有处理的NH3排放主要集中在前期高温阶段。CK、DP 和NS 组的NH3日排放量均在第6 天达到峰值，分别为0.30、0.24和0.57 g·kg-1DM。到第14 天，各处理组基本无NH3产生。从图4(b)可以看出，各处理NH3累计排放量在前7 天内迅速增加，此后增速降低并逐渐趋于平缓。堆肥结束时，CK、DP 和NS 组的NH3累计排放量分别为0.85、0.55 和1.61 g·kg-1DM。与CK 组相比，DP 组NH3累计排放量减少了34.55%，与NS 组相比减少了65.54%。
图4 堆肥过程中的NH3 日排放量(a)和累计排放量(b)变化Fig.4 Changes in (a) daily NH3 evolution and (b) cumulative NH3 evolution during composting
2.2 腐熟度
2.2.1 腐殖酸变化
图5(a)为堆肥前后总腐殖酸含量变化。由图可知，堆肥后各处理的总腐殖酸含量显著增加，说明堆肥过程促进了物料的腐熟与稳定[17]。堆肥结束后CK、DP 和NS 处理的总腐殖酸含量从最初的148.28、116.39 和102.08 g·kg-1DM 分别增加到了240.53、282.95 和262.50 g·kg-1DM。在初始总腐殖酸含量低于CK 组的情况下，DP 组和NS 组总腐殖酸含量在堆肥结束时分别比CK 组提高了17.64%和9.13%，说明添加牡蛎壳有利于促进腐殖酸的形成。
图5 堆肥前后总腐殖酸(a)、HA(b)、FA(c)和HA/FA(d)变化Fig.5 Changes in (a) total humic acid,(b)HA,(c)FA and (d) HA/FA after composting
堆肥前后富里酸(FA)和胡敏酸(HA)含量变化见图5(b)和(c)，所有处理组的FA 含量都呈现下降趋势，而HA 含量则显著增加(P＜0.05)。这是因为FA 具有一定活性，在堆肥过程中容易被微生物利用，或者向胡敏酸(HA) 转化[18]。堆肥结束后，CK、DP 和NS 处理的富里酸和胡敏酸含量分别为41.43、18.94、15.78 g·kg-1DM 和199.10、264.01、246.73 g·kg-1DM。如图5(d)所示，堆肥前后各组的HA/FA比值均呈现增加的趋势。CK、DP 和NS 处理组的初始HA/FA 分别为2.24、2.35 和1.50，而最终产品中的比值分别为4.81、13.94 和15.64，说明牡蛎壳粉有利于促进堆肥腐殖化程度。从总腐殖酸和胡敏酸含量变化来看，以豆粕为氮源进行糖渣堆肥处理牡蛎壳优于以尿素为氮源。
2.2.2 傅里叶红外光谱(FTIR)分析
FTIR 光谱被广泛用于检测堆肥样品中化学键和官能团的变化和多样性[19]。各处理堆肥前后的FTIR 见图6。与CK 不同，DP 和NS 处理在1 430，875 和713 cm-1三处均有明显的吸收峰，此为碳酸盐的特征峰[20]。3 400 cm-1附近有一个强烈的吸收带，通常可归因于羟基、醇、酚和有机酸的O-H 拉伸[21]。2 923 cm-1附近的吸收峰与脂肪族碳相关，堆肥结束后各处理在此处的峰值均变缓，可能是由于微生物介导的脂肪族亚甲基的矿化、挥发或转化，表明堆肥逐渐变得成熟稳定[22]。1 030 cm-1附近的峰，通常与多糖有关[23]。此处峰值在堆肥后也有所变缓，说明经过堆肥后，微生物活动对多糖进行了降解，特别是在DP 和NS 两组处理中较为明显，说明添加牡蛎壳粉有利于促进堆肥的腐熟。
图6 堆肥前后傅里叶红外光谱变化Fig.6 Changes in FTIR after composting
2.2.3 发芽指数
种子发芽指数(GI)是常用的评估堆肥产品成熟度和植物毒性的指标[21]。堆肥前后发芽指数变化见表2。CK、DP 和NS 组第0 天的GI 分别为92%、98%和64%，经过35 d 发酵后GI 分别为100%、104%和91%，所有处理的GI 均大于80%，说明堆肥产品没有植物毒性，是安全的。堆肥结束后，DP 组GI 最高，说明以豆粕为氮源进行堆肥更为合适。
表2 堆肥前后发芽指数变化Tab.2 Changes in GI of piles after composting
2.3 堆肥前后有效态钙变化
从表3 堆肥前后有效态钙含量变化中可以看出，发酵后各处理的水溶态钙含量均呈现下降趋势，而交换态钙则呈现增加趋势。堆肥结束后，CK 组和DP 组的交换态钙含量分别从2.70 和7.82 g·kg-1增加到了7.90 和12.56 g·kg-1。牡蛎壳的加入增加了混合物的初始有效态钙含量，堆肥结束后，有效态钙含量进一步增加，特别是DP 组，堆肥后有效态钙含量从9.32 g·kg-1升高到13.40 g·kg-1，增加了43.78%。堆肥结束时，DP 组有效态钙含量较CK 组高出37.39%。从数据表中可以看出，以豆粕为氮源进行堆肥更有利于增加有效态钙含量。
表3 堆肥前后有效态钙含量变化Tab.3 Changes in effective state calcium content of piles after composting
牡蛎壳作为一种天然生物材料，含有大量碳酸钙及多种微量元素，同时具有多孔结构，能有效改善土壤酸化问题，减少养分损失，增加土壤微生物丰富度，显著降低土壤中重金属的生物有效性，是良好的土壤调理剂[24-26]。本试验以豆粕和尿素为不同氮源，通过好氧堆肥工艺对牡蛎壳进行处理，以期丰富牡蛎壳的资源化利用途径，同时提高最终堆肥产品的品质。
试验过程中DP 组和NS 组温度略低于CK 组，可能是因为牡蛎壳的添加使得有机物料占比较少，进而导致产生的热量较少，但两处理组的温度下降幅度较小，未对堆肥过程产生负面影响，说明通过堆肥处理牡蛎壳是可行的。NS 组在堆肥过程中温度最低，高于60 ℃的时间也最短，这可能是因为尿素的添加使得堆体内微生物的丰富度和活性相对较低[27]。pH 和EC 是反映堆肥质量的重要指标[28]。堆肥初期各处理的pH 在6.10～7.23 之间，虽然在堆肥过程中有所升高，但最终堆肥结束时各处理的pH 都回落在6.79～7.94之间。pH 值的升高可能是高温条件下有机氮的氨化和矿化导致的，而堆肥过程中微生物活动产生的有机酸则会导致pH 的降低[29-30]。EC 值过高会影响堆肥体系中的微生物活性，不利于腐殖化过程的进行[31]。本试验各处理初始EC 值在0.91～1.33 mS·cm-1之间。堆肥初期各处理EC 值略有增加，这可能是易降解有机物被微生物分解导致的，而在3～14 d 各处理EC 值有所下降，可能是CO2和NH3的排放，以及腐殖酸的增加等原因导致的[18]。此后由于有机物的矿化以及“浓缩效应”，EC 值在整个堆肥过程中逐渐增加[32]。堆肥结束后所有处理的EC 值均＜4 mS·cm-1，不会对植物产生毒害作用[33]。
堆肥过程中NH3的排放不仅会造成氮素损失，对堆肥品质造成负面影响，而且还会对周边环境造成污染[34]。本试验中氨气大量排放主要集中在前7 d，此后逐渐减少，到堆肥结束时CK、DP 和NS 组的NH3累计排放量分别为0.85、0.55 和1.61 g·kg-1DM。NS 处理的NH3累计排放量最大，这可能是由于尿素在高温环境下快速氨化导致的[35]。与CK 组相比，DP 组NH3累计排放量减少了34.55%，说明牡蛎壳的加入能减少堆肥过程中的NH3排放，这可能是因为牡蛎壳孔隙度较高，具有一定的吸附作用[36]。与NS 组相比，DP组NH3累计排放量减少了65.54%。因此，以豆粕为氮源进行堆肥可以有效减少NH3排放，减少氮损失。
腐殖酸含量变化与堆肥过程中的有机质转化和堆肥成熟度有关[37]。本试验中，在初始总腐殖酸含量低于CK 组的情况下，DP 组和NS 组总腐殖酸含量在堆肥结束时分别比CK 组高出了17.64%和9.13%，说明添加牡蛎壳有利于促进腐殖酸的形成。HA/FA 常用来反映腐殖化水平和堆肥成熟度，特别是胡敏酸和富里酸之间的转换[38]。堆肥结束后，所有处理的HA/FA 均大于1.7，说明堆肥已经成熟[39]。堆肥结束时，DP 和NS 组的HA/FA 远高于CK 组，说明牡蛎壳粉可以促进堆肥腐殖化程度，有利于堆肥的成熟，这一点从堆肥前后的FTIR 光谱变化中也可以得到证明。通常认为GI 高于80%时，堆肥达到成熟阶段，即不会对植物产生毒害[40]。由于本试验所用原料自身特点，所以第0 天发芽指数高于常见的畜禽粪便堆肥[41]。NS 组的GI在第0 天远低于其他组，可能是因为堆肥初期尿素含量较高，产生了抑制作用。
水溶态钙和交换态钙均属于可以被植物吸收利用的有效态钙[42]。向堆肥中添加牡蛎壳可以直接增加有效态钙含量。从堆肥前后钙形态的变化可以看出，经过堆肥后，有效态钙含量呈现增加的趋势。以DP 组为例，堆肥后有效态钙含量从9.32 g·kg-1变为13.40 g·kg-1，增加了43.78%。从数据表中可以看出，以豆粕为氮源进行堆肥更有利于增加最终产品中的有效态钙含量。
在糖渣堆肥处理牡蛎壳过程中，虽然温度略低于CK 组，但各处理的最高温度均高于60 ℃，pH 在6.79～7.94 之间，EC 值＜4 mS·cm-1。说明牡蛎壳的添加不会对堆肥的理化性质产生负面影响。
堆肥结束时，各处理GI 均高于80%，最终产品没有植物毒性。DP 组的GI 最高为104%，并且总腐殖酸含量也较CK 组增加了17.64%，说明牡蛎壳可以促进堆肥的腐熟。
DP 组最终氨气累计排放量比CK 组降低了34.55%，有效态钙含量增加了37.39%，说明以豆粕为氮源，将牡蛎壳与糖渣共堆肥可以促进氮保留并增加有效态钙含量，提高最终堆肥产品的质量。
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