盛福楠，刘晗，贾梦，汪轩羽，李秀荷，王慧芳，王志伟，戴福宏，高铁成，周中凯*，李宁*
（1.天津科技大学食品科学与工程学院，天津 300457；
2.新疆三礼粮油有限公司，新疆图木舒克 843900；
3.广州焙乐道食品有限公司，广东广州 511400）
油莎豆（CyperusesculentusL.）又名虎坚果，是莎草科一年生植物，原产于非洲和地中海沿岸国家，是一种优质、高产、综合利用价值高的新型油料和粮食作物[1]。油莎豆中富含淀粉和脂肪，分别占干重的26%～30% 和21%～25%，同时还含有蛋白质（8%）和微量元素（1.7%），具有较高的营养价值和食用价值，可以被加工为饮料和零食，也用于牛轧糖、果浆、啤酒和冰激凌的调味剂[2-3]。
油莎豆应用广泛，是一种有效的淀粉来源，但目前在我国油莎豆主要用于油料作物，关于淀粉的理化特性并不完善[4]。油莎豆淀粉是一种无味，外观呈白色的粉末，先前研究表明，油莎豆淀粉中直链和支链的比例是1∶3，具有良好的耐酸性、冻融稳定性和凝胶强度，与玉米淀粉和马铃薯淀粉相似，较优于这两种淀粉，因此在工业应用中具有巨大的潜力，可用于复合材料、食品、纺织和制药行业[5-7]。淀粉的流变特性是其应用的重要质量指标，了解流体的流动类型可以进一步明确食品的组分、内部结构和分子形态等性能，有助于更好地利用淀粉资源[8]。淀粉回生是热加工淀粉食品在储藏过程中不可避免的现象，指淀粉在糊化后，淀粉分子从无序到有序重结晶的过程，在一定程度上会影响食品的品质及货架期[9]。大量研究者通过回生制备抗消化淀粉，且先前研究表明小麦淀粉经3 次循环回生后可显著改变其结构特征，并提高了抗性淀粉的含量[10]。因此，作为一种新型的淀粉资源，对油莎豆淀粉的回生特性研究对其加工利用尤其重要。
目前，对于油莎豆淀粉的研究我国仍处于初期阶段，且先前研究多集中于基本结构及糊化特性，对其流变特性和回生特性鲜见报道。本研究通过提取油莎豆中淀粉，并以玉米淀粉为对照，探究不同浓度的淀粉溶液对其流变特性的影响，以及循环热处理对油莎豆淀粉结构及理化特性的影响，以期为油莎豆淀粉的开发利用提供理论依据。
1.1 材料与试剂
油莎豆豆粕：新疆三礼粮油有限公司；
玉米淀粉（corn starch，CN）：天津文星淀粉有限公司；
唾液淀粉酶（500 U/g）、胃蛋白酶（15 000 U/g）、中温α-淀粉酶（2 000 U/mL）、糖化酶（100 000 U/mL）：阿拉丁试剂（上海）有限公司；
盐酸、无水乙酸钠（均为分析纯）：天津江天化工技术有限公司；
葡萄糖试剂盒：长春汇利生物科技有限公司；
1.2 仪器与设备
快速黏度分析仪（Techmaster）：Newport Scientific公司；
动态流变仪（HAAKE，MARS60）、傅里叶变换红外光谱仪（IS50）：德国赛默飞世尔科技公司；
差示扫描量热仪（Mettler-Toledo，DSC3）：瑞士梅特勒-托利多集团；
低场核磁（Micro MR-25）：上海纽迈电子科技有限公司；
偏光显微镜（59XC-PC）：上海光学仪器一厂；
水浴摇床（TS-110XS）：上海科辰试验设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 油莎豆淀粉的提取
油莎豆淀粉的提取参照Yu 等[11]的方法并略作修改，将油莎豆豆粕反复水洗多次，用纱布过滤，除去杂质后4 000 r/min 离心15 min，将离心后的沉淀物浸于pH10 的碱液中，常温搅拌2～3 h，然后4 000 r/min 离心15 min 弃去上清液。沉淀物质反复水洗，以除去杂质。沉淀用无水乙醇清洗，将烘干后的样品磨粉后过100 目筛备用，即油莎豆淀粉（Cyperusesculeutusstarch，YN）。
1.3.2 不同淀粉浓度的糊化特性测定
分别称取玉米淀粉（CN）和油莎豆淀粉（YN）放于铝筒中，加入25 mL 水，分别配制成质量分数为8%、12%的玉米和油莎豆淀粉溶液，记为CN-8%、YN-8%、CN-12%、YN-12%。参照GB/T 24852—2010《大米及米粉糊化特性测定快速粘度仪法》，用快速黏度分析仪（rapid viscosity analyzer，RVA）测定，研究不同淀粉浓度对淀粉糊化特性的影响[12]。
1.3.3 淀粉的流变特性测定
将经RVA 糊化后的两种不同浓度的玉米和油莎豆淀粉冷却至室温，测定其流变特性[13]。
动态流变特性测定：使用直径35 mm 的平板，上下板间隙设定为0.1 mm，温度为25 ℃，对样品进行振幅扫描，测定频率范围为0.1～10 Hz，扫描应变为0.5%，得到样品的储能模量（G′）和损耗模量（G″）随频率的变化情况。
静态流变特性测定：测试温度25 ℃，剪切速率从0 s-1增加至300 s-1，再从300 s-1降低至0 s-1，测定剪切应力随剪切速率的变化趋势。
1.3.4 循环热处理回生淀粉的制备
回生淀粉的制备参照Hu 等[10]的方法，将浓度为8%、12% 的油莎豆与玉米淀粉悬浮液，放于高压锅中使其彻底糊化，将糊化后的淀粉放至4 ℃冰箱回生24 h后，将样品再次放入高压锅内进行第二次糊化后，放入4 ℃冰箱再次回生24 h，如此反复3 次，得到3 次回生样品，将回生处理后的样品冻干后碾磨，并过100 目筛，以备后用。回生后的玉米淀粉（retrograded corn starch，RCN）和回生后的油莎豆淀粉（retrogradedCyperusesculeutusstarch，RYN）分别记为RCN-8%、RYN-8%、RCN-12%、RYN-12%，8% 和12% 分别代表淀粉浓度。
1.3.5 热力学特性测定
称取4 mg 样品放于铝制坩埚内，然后加入10 μL的去离子水，搅拌均匀后压片密封，室温平衡6 h 进行测定，以空铝制坩埚作为空白对照。测试温度范围为25～125 ℃，升温速率为10 ℃/min。
1.3.6 傅里叶变换红外光谱分析
称取1 mg 的样品和150 mg 的溴化钾于研钵中混合碾碎，放入模具中压片1 min，对样品进行扫描分析。扫描波数范围4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，扫描累加16 次。
1.3.7 水分迁移变化规律测定
利用低场核磁测定糊化后的原淀粉和回生后的淀粉凝胶内部水分分布的情况[14]，测定参数：主频SF=22 MHz，偏移频率O1=388 981.83 Hz，90°脉冲射频脉宽P1=5.00 μs，信号采样点数TD=80 012，重复采样等待时间TW=1 000.00 ms，重复采样次数NS=8，回波时间TE=0.4 ms。
1.3.8 体外消化特性测定
淀粉的消化特性参照Xiao 等[12]的方法，并略作修改。准确称取200 mg 样品于锥形瓶中，加入300 μL的唾液淀粉酶溶液，37 ℃在水浴振荡5 min，然后加入15 mL 的胃蛋白酶振荡30 min，在反应液中依次加入15 mL NaOH、25 mL 醋酸钠缓冲液和10 mL 复合酶溶液，于37 ℃水浴摇床中继续反应。在反应期间，取0、20、120 min 的反应液于沸水中灭酶10 min后10 000 r/min 离心10 min，用葡萄糖试剂盒法测定样品中葡萄糖释放量。
1.3.9 淀粉颗粒的偏光显微镜分析
准确称量0.1 g 样品于离心管中，加入5 mL 的去离子水，摇匀。将溶液滴于载玻片中央，放于显微镜下，选择合适的放大倍数，分别在普通光与偏振光下拍摄淀粉颗粒形貌。
1.4 数据处理
采用Origin Pro 9.0 以及SPSS 19 对试验数据进行处理及显著性统计分析，其显著性差异水平为P＜0.05，且所有试验均重复3 次。
2.1 不同淀粉浓度对油莎豆淀粉黏度特性的影响
RVA 反映淀粉的糊化、崩解、膨胀和凝胶特性，广泛用于评价淀粉在食品基产品中的蒸煮特性和食用品质[15]。油莎豆淀粉和玉米淀粉的黏度曲线如图1 所示。不同浓度油莎豆淀粉和玉米淀粉黏度特性参数如表1 所示。
表1 不同浓度油莎豆淀粉和玉米淀粉黏度特性参数Table 1 Viscosity parameters of Cyperus esculentus starch and corn starch
图1 油莎豆淀粉和玉米淀粉的黏度曲线Fig.1 Viscosity curve of Cyperus esculentus starch and corn starch
由图1 和表1 可得，油莎豆淀粉和玉米淀粉在浓度8%时其峰值黏度无显著差异，而在浓度12%时油莎豆淀粉的峰值黏度（4 049.67 cP）显著高于玉米淀粉（3 278.33 cP），但最终黏度无显著差异。峰值黏度是指淀粉颗粒在加热过程中吸水膨胀而相互摩擦产生的最高黏度，在本研究中，油莎豆淀粉较高的峰值黏度表明其具有较强的吸水溶胀能力，可能与淀粉颗粒大小有关，研究表明油莎豆淀粉的粒径在2～15 μm，而玉米淀粉在15～25 μm[16]。浓度8% 时峰值黏度无显著差异可能是淀粉分子在低浓度时产生空间位阻较大，阻碍了淀粉之间的聚集因而产生较低的黏度。相比于玉米淀粉，油莎豆淀粉呈现出较大的崩解值，表明其具有较弱的抗剪切能力，可能是淀粉内部结构较为松散，形成的凝胶结构不稳定[17]。回生值是最终黏度和谷值黏度的差值，反映了淀粉分子在冷却过程中发生重排使黏度增加的过程，通常回生值不仅与直链淀粉含量有关，还与淀粉中直链淀粉的链长和支链淀粉的大小有关[8]。本研究中，油莎豆淀粉的回生值显著高于玉米淀粉，且浓度越高回生值越高，表明油莎豆淀粉内部分子结构易退化和聚集，具有较强的回生特性，这可能与其较高的直链淀粉含量有关，已有研究表明，油莎豆淀粉中直链淀粉含量高于玉米淀粉[16]。
2.2 不同淀粉浓度对油莎豆淀粉流变特性的影响
动态流变特性是指储能模量（G′）和损耗模量（G″）随角频率的变化趋势，G′通常代表了淀粉糊在形变过程中由于弹性所引起的能量储存，反映了凝胶网络的刚性和弹性，G″代表了淀粉糊由于黏性变形过程中所损失的能量，反映凝胶网络的黏性特征[12]。玉米淀粉和油莎豆淀粉的流变特性曲线如图2 所示。
图2 玉米淀粉和油莎豆淀粉的流变特性曲线Fig.2 Rheology curve of Cyperus esculentus starch and corn starch
由图2 可知，两种淀粉糊的G′和G″具有频率依赖性，且G′均高于G″并无交叉，表明两种淀粉所形成的凝胶网络具有较强的弹性特征，呈现出弱凝胶行为[13]。相比于玉米淀粉，油莎豆淀粉形成的凝胶网络呈现出较低的G′和G″，且油莎豆淀粉的G′随频率的增加而增加，表明油莎豆淀粉所形成的淀粉凝胶网络在高频率下呈现出较强的弹性，与玉米淀粉有所不同。此外，浓度12%的淀粉溶液所形成凝胶呈现出较强的黏弹性，这与糊化特性相一致，这主要是由于当淀粉浓度较高时，渗出的直链淀粉含量较高，淀粉分子间的氢键交联度高，形成的凝胶网络较强[18]。由图2c 可知，损耗正切角均（tanα）小于1，表明这两种淀粉所形成的凝胶更类似于固体，且tanα 随着频率的增加逐渐增加，表明样品在高频率下呈现出更黏的凝胶网络特征[19]。此外，相比于玉米淀粉，油莎豆淀粉呈现出较高的tanα，表明G″的增长速率高于G′，且呈现出较强的流动性。
图2d 测定了样品的触变特性，样品在高速剪切作用下，内部的网络结构受到破坏，当剪切速率降低时，在短时间内样品不能恢复到原始的状态，因而形成一个闭合的触变环[20]。触变环面积的大小代表了样品受破坏的程度，面积越大表明受到破坏程度越大，越难以恢复到原来的状态[8]。由图2d 可得，油莎豆淀粉的剪切应力在低剪切速率下极速增加，淀粉分子间氢键断裂，凝胶网络结构遭到破坏，并在高频率下逐渐稳定，表明淀粉分子从开始的网络结构转为定向流动，表现出剪切稀化行为[20]。此外，油莎豆淀粉的触变环面积明显大于玉米淀粉，且浓度越高面积越大，表明油莎豆淀粉所形成的凝胶网络易被破坏，抗剪切力差，而玉米淀粉具有较强的抗剪切能力，这可能是由于油莎豆淀粉分子间相互作用较弱，分子间的氢键难以在短时间内恢复。
2.3 油莎豆淀粉的回生特性
2.3.1 循环热处理对油莎豆淀粉热力学特性的影响
利用差示扫描量热仪（differential scanning calorimeter，DSC）测定油莎豆淀粉和以及经循环热处理后淀粉的热力学特性，包括糊化焓值（ΔH）和糊化温度（起始温度T0、峰值温度TP、终值温度TC）。原淀粉和回生后淀粉的DCS 曲线如图3 所示，热力学参数如表2 所示。
表2 原淀粉和回生后淀粉的热力学参数Table 2 Thermal parameters of native and retrograded starch
图3 原淀粉和回生后淀粉的DCS 曲线Fig.3 Differential scanning calorimeter（DSC）curve of native and retrograded starch
由图3 和表2 可知，相比于玉米淀粉，油莎豆淀粉的ΔH略低，ΔH代表淀粉在加热过程中破坏其结晶区和非结晶区双螺旋结构时所需要的能量，因此油莎豆中较低的糊化焓值表明其淀粉的晶体结构略弱于玉米淀粉，可能与其较低的结晶度有关[9]。淀粉回生是指糊化后的淀粉分子由无序向有序状态的转变，通常与淀粉的种类、直链淀粉含量以及支链的链长有关[21]，由图3 可知，经回生后淀粉的糊化温度在40～60 ℃，糊化焓值在0.9～1.6 J/g 之间，表明这两种淀粉在回生过程中形成了支链淀粉的重结晶结构[22]。此外，在本研究中，淀粉在低浓度下（8%）的ΔH值更大，表明其更易发生回生，这可能是在高水分含量下，淀粉分子链的迁移速度高，且水分子可参与淀粉分子间的重结晶，促进了氢键的结合，形成较为完整的晶体结构[22]。同时，由表2 可知，回生后的油莎豆的糊化温度范围（TC-T0）显著低于玉米淀粉，这表明油莎豆淀粉在回生过程中可形成的较均一的支链淀粉晶体[10]。
2.3.2 循环热处理对油莎豆淀粉短程有序结构的影响傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）是一种测量碳水化合物分子间相互作用和构象转变的技术，是研究淀粉回生的一种简单、快速的方法。原淀粉和回生淀粉的傅里叶红外光谱与IR1047cm-1/1022cm-1比值如图4 所示。
图4 原淀粉和回生淀粉的傅里叶变换红外光谱图与IR1 047 cm-1/1 022 cm-1比值Fig.4 Fourier transform infrared spectroscopy and IR1 047 cm-1/1 022 cm-1 of native and retrograded starch
由图4 可知，红外图谱中在3 700～3 000 cm-1范围内有的较宽吸收峰，通常与淀粉间氢键的伸缩振动有关，而在淀粉回生过程中，氢键是淀粉链形成双螺旋的主要作用力[18]。淀粉溶液浓度为8% 时，其氢键的羟基拉伸振动峰向较低的波数出移动，表明淀粉分子间的氢键作用力加强，具有较高的回生程度，这与DSC的结果一致[23]。此外，红外光谱在1 200～800 cm-1范围内主要与C—C 和C—O 键的拉伸有关，反映了淀粉的短程有序结构，其中1 047 cm-1和1 022 cm-1的吸收峰分别与淀粉的结晶区与无定形区有关，大量研究者用IR1047cm-1/1022cm-1的比值来评估淀粉在回生过程中的短程有序结构，其比值越大表明淀粉分子的回生程度越高，形成的晶体结构更加完美[18，24]。由图4 可知，低浓度下的IR1047cm-1/1022cm-1较高，表明低浓度下的淀粉溶液可促进淀粉分子间氢键的结合，促进了淀粉的回生。经回生处理后，油莎豆淀粉的IR1047cm-1/1022cm-1值高于玉米淀粉，表明油莎豆淀粉在回生过程中的所形成的双螺旋堆积密度较强，回生程度较高，这与RVA测定的回生值结果一致。
2.3.3 循环热处理对油莎豆淀粉水分分布的影响
低场核磁测定样品中的水分迁移规律，结果如图5所示。
图5 原淀粉与回生淀粉的水分迁移变化Fig.5 Water migration of native and retrograded starch
由图5 可知，有3 种迁移率不同的水分分子，第一个峰的豫弛时间为0.1～1 ms，第2 个峰为1～100 ms，第3 个峰在100～1 000 ms，分别用T21、T22和T23表示，分别代表了凝胶体系中的紧密结合水、弱结合水和自由水[14]。淀粉在回生过程中其弛豫时间（T21、T22和T23）均向左移动。先前研究表明，回生时间的增加可降低样品中的豫弛时间，这主要是由于淀粉分子聚集并重新排列，导致水分子的流动性受到限制[23]。此外，回生样品中的自由水峰面积明显增加，而结合水降低，表明了淀粉在回生过程中发生了水分迁移。淀粉回生过程中，淀粉链之间的氢键重新结合，导致水分子与淀粉之间的氢键断裂，结合水转化为游离水，从而使自由水含量增加[14]。此外，低浓度淀粉溶液（8%）经回生后所形成的凝胶中结合水的峰面积明显降低，表明其回生程度较高，研究表明淀粉分子链的迁移速率会受到体系中的水分的影响，而较高的水分含量可加速淀粉分子链间的聚合[22]。
2.3.4 循环热处理对油莎豆淀粉消化率的影响
淀粉是人类日常饮食中碳水化合物的主要来源。淀粉按消化率可分为3 类：快速消化淀粉（rapidly digestible starch，RDS）、慢消化淀粉（slowly digestible starch，SDS）和抗性淀粉（resistant starch，RS）[25]。RDS通常在口腔和小肠内快速消化吸收，SDS 是指在小肠中消化吸收较慢的淀粉，而RS 指小肠内无法消化吸收，需到达大肠内被微生物所降解的淀粉。SDS 和RS对消费者健康有积极作用，包括血糖控制、抑制结肠癌和肥胖发病率[26]。其中RS 分为5 个亚型（RS1～RS5），RS3 属于回生淀粉，是通过直链淀粉回生或支链淀粉的重结晶/重排获得的[27]。原淀粉和回生后淀粉的RDS、SDS 和RS 含量如表3 所示。
表3 原淀粉和回生后淀粉的RDS、SDS 和RS 含量Table 3 Content of rapidly digestible starch（RDS），slowly digestible starch（SDS），and resistant starch（RS）in native and retrograded starch%
由表3 可知，油莎豆淀粉和玉米淀粉的RDS、SDS和RS 无明显变化，且原淀粉的RS 显著高于回生淀粉，主要是由于回生淀粉在糊化过程中其晶体结构遭到严重破坏，促进了消化酶的作用。经回生后油莎豆淀粉的SDS 和RS 均高于玉米淀粉，表明回生后油莎豆淀粉具有较强的抗消化性能，这可能与其形成的较紧密的结晶结构有关。已有研究表明，回生过程中的淀粉分子可通过氢键形成晶体结构，致密的晶体结构可抑制消化酶进入颗粒内部，其中不完美的晶体结构与SDS 有关，而RS 主要与较完美的晶体有关[10]。此外，低浓度的淀粉溶液呈现出较高的RS，与高浓度的淀粉溶液相比分别增加6.39% 和6.52%，表明低浓度下的淀粉凝胶更易形成完美的晶体结构。
2.3.5 循环热处理对油莎豆淀粉淀粉偏光十字特性的影响
偏光显微镜可观察到淀粉颗粒的晶球结构，淀粉的晶体结构在偏振光照射下会出现偏光十字，偏光十字的变化在一定程度上可反映淀粉颗粒内部结晶结构及其比例的变化[28]。原淀粉和回生淀粉偏光显微镜图如图6 所示。
图6 原淀粉和回生淀粉偏光显微镜图Fig.6 Polarization micrographs of native and retrograded starch
由图6 可知，原淀粉呈现出较强的偏光十字现象，且十字中心位于淀粉颗粒中心，表现出典型的淀粉球晶结构，玉米淀粉呈现出多边结构，且颗粒较大，而油莎豆淀粉表面光滑、偏光十字较小且密集，表明油莎豆淀粉具有较小的粒径。回生后淀粉的偏光十字消失，但偏振光下有不规则的片状亮区，研究表明，在淀粉颗粒糊化后的重结晶过程中，较小的晶体会有序聚集，形成新的固态结晶产物，这可能是其产生亮区的原因[29-30]。此外，油莎豆形成的亮区更多，表明经回生处理的油莎豆淀粉更易形成晶体结构，这与DSC 和FTIR 所测定的结果一致。
通过探究油莎豆淀粉的流变特性和回生特性。结果表明，相比于玉米淀粉，油莎豆淀粉颗粒表面光滑，粒径较小；
高浓度的油莎豆淀粉呈现出更高的峰值黏度、崩解值和回生值；
流变特性显示，油莎豆淀粉形成凝胶网络的黏弹性较低，流动性较高，且油莎豆淀粉具有剪切稀化行为，触变环面积较大，抗剪切能力较弱。经循环热处理后的油莎豆淀粉在偏振光下呈现较大的亮区，具有较高的回生焓值和较小的糊化温度范围，且低浓度的淀粉溶液回生焓值越大；
FTIR 结果显示，循环热处理后的油莎豆淀粉呈现出更高IR1047cm-1/1022cm-1比值，形成更紧密的短程有序结构；
且油莎豆淀粉凝胶体系中的自由水比例明显增加，弛豫时间降低，进一步表明该淀粉分子链间更易于结合，且较高的水分含量促使了分子链之间的缠结；
消化特性表明，原油莎豆淀粉和玉米淀粉的RDS、SDS 和RS 无明显变化，但循环热处理后的油莎豆淀粉呈现出较高的SDS 和RS，且在低浓度下呈现出更强的抗消化特性。本研究为油莎豆淀粉产品的开发和利用提供了理论指导。