李德芳 蒋理想 复旦大学附属金山医院 （上海 201508）
内容提要：
目的：探索自制笼具建立双后肢大鼠椎间盘退变动物模型的影像学和形态学特点。方法：将新生幼鼠自肱骨上段用丝线结扎，然后截去双前肢。用特制的可不断加高笼饲养，改变其饲养条件，迫使大鼠只有依靠双后肢站立才能进食和饮水的活习惯，以此训练大鼠类似于人类直立活动。2周、4周、8周、24周摄腰椎侧位片及磁共振成像检查，测定椎间隙高度指数，按Pfirrmann分级。制作组织切片，HE染色后进行组织学评估。结果：造模2周X射线片显示，腰椎生理弯曲正常，椎间隙未见明显狭窄。随着时间延长，24周时椎体边缘变锐，终板软骨下骨密度增加，部分出现骨赘。磁共振成像时椎间盘信号改变，严重者出现“黑椎间盘”。Pfirrmann分级明显增加。组织学评分不断升高。结论：特制增高笼具结合双后肢大鼠可以建立椎间盘退变动物模型，使其更接近于人体自然退变，可用于椎间盘退变的研究。
椎间盘退行性变是引起腰部疼痛的重要病因，目前的治疗措施无论保守治疗还是手术治疗都无法从病因上治疗椎间盘退变，鉴于此学者们开始探索分子治疗、基因治疗或细胞治疗等生物治疗的方式，以期从源头上解决退变椎间盘内髓核细胞数量减少和细胞外基质的合成减少的问题。这就需要合适的椎间盘退变动物模型来研究椎间盘退变的发生机制和检测各种治疗手段有效性，可靠的动物模型为深入研究椎间盘的发病机制及治疗手段提供可靠的载体。目前，文献中介绍的椎间盘退变动物模型多种多样，大致可以分为直接结构损伤模型、机械间接应力模型、自发模型、基因敲除模型等，每一种模型引起退变的机制亦不相同，或急性损伤，或化学刺激或基因敲除等，都无法模拟人体自然退变的过程[1-6]。本研究中介绍了一种双后肢大鼠模型结合自制增高笼具的造模方法，该方法通过模拟人类直立活动、进食，增加大鼠脊柱负重，增加退变，尽量模拟人类脊柱退变过程，为椎间盘退变的体内研究提供可靠模型。
1.1 一般材料
3月龄SD大鼠8只，约250～300g[斯贝福（北京）生物技术有限公司提供]；
其中，雌鼠6只，雄鼠2只；
自制增高笼具；
外科手术器械等。
1.2 方法
1.2.1 双后肢大鼠动物模型的建立
该动物实验通过上海市公共卫生临床中心审核通过。由雌雄鼠自由交配的方法获取新生幼鼠40只，进行双后肢大鼠模型建立，大致过程为：将幼鼠置提前置于4°C冰箱低温处理，以收缩四肢血管，减少后续操作中出血。双前肢碘伏消毒，自肱骨上段用丝线结扎，然后截去双前肢，创面消毒按压止血。雌鼠哺乳喂养至第3周，待建模鼠能自行进食后移走母鼠。密切观察大鼠进食饮水时的高度，在以后的试验中用特制的加高笼饲养，改变其饲养条件，迫使大鼠只有依靠双后肢及尾部支撑站立才能进食和饮水的生活习惯，以此训练大鼠类似于人类的直立活动，成功建立双后肢大鼠模型20只，同时取同龄20只作为对照组。
1.2.2 特制笼具制作
测量实验室用大鼠饲养笼具的长宽高，定制相等长宽的铝合金增高框架，高度为3cm，随着大鼠身高的增加，增加增高框的层数，每层间打孔，可用钢丝固定。
1.3 观察指标与判定标准
1.3.1 观察大鼠进食、生活习性
观察笼具增高后大鼠进食时大鼠能否正常进食。观察大鼠能否利用双后肢行走。
1.3.2 影像学检测
X射线摄片测量椎间隙高度变化：两组动物在2周、4周、8周、24周摄脊柱侧位片，并做好标记，给动物做好编号。根据两组不同编号名称，在图像存档和传输系统中调出相应X射线片，运用系统测量功能，测量侧位片上腰椎的椎间盘高度。为了减少因体位及大鼠生长快慢、体重等因素引起的误差，检测椎间盘相对高度：分别测量椎间盘前部、中间及后部3个位置的高度求取平均值，同样旳方法，依次测量该椎间盘上下位两椎体前、中、后3个位置的高度，取均值，两者的比值即为椎间盘的相对高度（椎间盘高度指数）。
磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging，MRI）检查椎间盘退变程度分级：两组动物在2周、4周、8周、24周摄脊柱MRI片，了解随着时间推移造模组椎间盘信号改变。按照Pfirrmann分级对MRI影像进行分级，该分级系统根据MRI上椎间盘的结构，髓核与纤维环的边界，椎间盘信号及椎间盘高度等4个方面的表现，将其分为5级，Ⅰ～V级退变程度不断加重。
1.3.3 椎间盘组织学观察
两组动物在2周、4周、8周、24周进行影像学检查后，取出脊柱，经固定，脱钙后制作病理切片，HE染色。根据Masuda等描述的椎间盘组织学分级标准，对椎间盘形态进行观察。该分级标准有4个观察指标，分别为纤维环断裂程度、纤维环和髓核边界断裂程度、髓核内细胞数量及细胞内液泡数量以及髓核内基质凝聚程度等，每个指标根据程度不同分为3分，评分范围从正常椎间盘的4分到严重退变椎间盘的12分，从组织学评估造模的退变程度。
1.4 统计学分析
所得数据以±s表示，应用Stata 10.0统计软件进行分析，检验标准P＜0.05具有统计学意义。非数值变量用Kruskal-Wallis（K-W）检验，组间两两比较用Bonferroni法。
2.1 生活习性观察
脱离母鼠后，两组动物均能自行进食，饮水，在体型、外观及毛发上没有明显差异。在笼中爬行时对照组大鼠利用四肢在垫料中行走，而双后肢大鼠则主要依靠后肢，借助腰腹部肌肉力量，呈现上半身半直立状态行走，步态稍蹒跚（图1a）。另外还观察到当把双后肢鼠单独放在笼中，其跳跃能力明显增强。随着身高增加，使用自制增高笼具后，双后肢大鼠能够直立进食饮水（图1b）。
图1.双后肢大鼠结合自制增高笼具构建椎间盘退变动物模型（注：1a.双后肢大鼠可依靠后肢及尾部支撑直立饮水；
1b.自制增高笼具，根据动物身高不断增高）
2.2 影像学检查
2周时摄腰椎X射线片，两组腰椎生理弯曲正常，椎间隙未见明显狭窄及骨赘形成，上下终板未出现软骨下骨硬化（图2a、2b）；
随时间延长，椎间隙高度呈现逐渐下降趋势，与对照组相比，双后肢造模组可见椎体边缘变锐，软骨下骨4d硬化增生明显，甚至在椎体前方形成骨桥（图2c、2d）。
图2.两组动物腰椎X射线片（注：2a.2周时对照组X射线片；
2b.2周时造模组X射线片；
2c.24周时对照组X射线片；
2d.24周时造模组X射线片）
2.3 椎间盘高度指数测量
结果发现随着时间延长，椎间隙呈现逐渐下降趋势；
而每个时间点上，造模组的下降趋势较对照组椎间盘高度指数下降更为明显，特别在24周时下降趋势有统计学差异，P＜0.05（见图3）。说明该模型能模仿体内椎间盘退变时椎间隙狭窄的病理改变。
图3.两组动物X射线片测量椎间盘高度指数
2.4 MRI检查
在造模早期MRI上可见椎间盘高度正常，信号较高呈白色或灰色，髓核的高信号与纤维环的低信号界限明确，随着造模时间延长，MRI上可见到椎间隙狭窄，髓核呈现低信号，髓核与纤维环界限消失（见图4）。Pfirrmann分级不断升高，与对照组有统计学差异，P＜0.05。
图4.两组动物MRI图像及Pfirrmann分级对比（注：4a.2周时对照组MRI图像；
4b.2周时造模组MRI图像；
4c.24周时对照组MRI图像；
4d.24周时造模组MRI图像；
4e.Pfirrmann分级统计图）
2.5 组织学观察
切片HE染色（见图5）后结果示对照组髓核呈现胶冻状，含水量较高，纤维环与髓核边界清晰，未见纤维环断裂。造模后期髓核出现明显退变表现，髓核含水量较低，细胞明显减少，细胞基质明显聚集呈现棉絮状，可见纤维环或终板断裂处，组织学评分明显升高，退变程度加重。
图5.两组动物椎间盘切片HE染色（注：5a.2周时对照组染色结果；
5b.2周时造模组染色结果；
5c.24周时对照组染色结果；
5d.24周时造模组染色结果；
5e.组织学评分统计图）
椎间盘退变的动物模型为体内研究椎间盘退变的机制及相关治疗方法提供了合适的载体。文献报道，理想的用于建立动物模型的动物需要满足以下条件：①与人椎间盘退变过程具有相似性和可比性；
②具有易操作性和经济性；
③具有可操作性和经济性[7]。从动物模型量化制造到实施的过程至今已经走过了将近75年，近年来比较倾向于用狗、羊、猪等传统动物制备动物模型。灵长类动物无论在进化方式或解剖结构方面来说均与人类最为相似，如恒河猴，是目前为止最理想的动物模型[8]。但它们数量少、价格昂贵、饲养困难，有些还受到相关国家法律的保护，难以广泛用于科研活动。目前最常用的是大鼠模型，饲养方便、价格便宜、繁殖迅速，且其椎间盘解剖结构与人类椎间盘结构极为相似。
目前已成功建立的动物模型可以分为两大类，一为诱导性退变，一为自发性椎间盘退变模型。后者的典型代表为沙鼠椎间盘退变动物模型，其退变过程与人类相似，同时较为迅速，但其种类有限，且研究认为其退变过程是遗传因素决定的[9,10]。近期也有学者报道了与小鼠年龄相关的自发性椎间盘退变的研究，结果表明，14月龄小鼠出现轻度但明显的椎间盘退变，退变程度进展缓慢，22月龄小鼠达到中度至重度。至少14个月的随访是评估自发性年龄相关性小鼠椎间盘退变的必要条件[11]。该方法虽然符合人类自然退变的进程，但造模周期过长，不便于研究。诱导性退变的方法主要为两大类，第一类为改变椎间盘生物力学环境诱发退变，动力轴向加压、切断脊柱周围软组织，可模拟部分重体力劳动人群的退变过程，对于因积累性反复轻微损伤导致的椎间盘退变不太符合[12]；
第二类为通过损伤椎间盘自身结构诱发退变，使用较多的为纤维环穿刺及软骨终板穿刺[13-15]。
本研究中使用大鼠制作动物模型，通过出生时截去双前肢，改变笼具高度和饲养条件，迫使其通过双后肢直立行走及进食，模拟人类对抗引起退变的最主要因素重力作用建立模型，可以避免其他化学、机械损伤，易于操作，重复性高。与对照组自然退变比较发现，随着时间推移造模组X射线片发现终板处软骨下骨硬化明显，椎间隙狭窄，椎体边缘变尖，骨赘形成，甚至观察到骨桥形成。在进行MRI检查后发现，椎间盘含水量明显下降，髓核信号明显下降，与纤维环界限不清，甚至出现黑椎间盘征象。取材进行组织学分析后发现，此时髓核内细胞明显减少，细胞内囊泡减少，本应该为胶冻状的髓核因退变逐渐转变成棉絮状，纤维含量较高，纤维环膨出，断裂，组织学评分明显高于对照组。因此认为该模型能较好模拟人类椎间盘退变应用于试验研究。
该模型可能存在不足之处，正如Mauro等[16]提到的动物和人类在细胞数量、组织组成、椎间盘和脊柱解剖、发育、生理和力学性能等方面存在许多差异。由于伦理和政府监管的限制，很难获得用于此类研究的人体材料，因此经常使用动物组织、器官和体内模型。另一方面该模型出现椎间盘显著退变的周期仍较长，导致实验周期长，耗费的人力、经费较大。
综上所述，特制增高笼具结合双后肢大鼠可以建立椎间盘退变动物模型，使其更接近于人体自然退变，可用于椎间盘退变的研究。
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