孙卢浩然，卢敏
（中国医科大学附属第一医院 1.泌尿外科；
2.肛肠外科，沈阳 110001）
结肠癌是一种常见的恶性肿瘤，死亡率较高［1-2］。常规化疗药物耐药是结肠癌预后差的重要原因［3-4］。二氢青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）对多种恶性肿瘤具有抗肿瘤作用［5-8］。前期研究［9］证实，DHA可通过内质网凋亡途径诱导结肠癌HCT-116细胞凋亡，肌浆/内质网钙 ATP 酶（sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase，SERCA）2b活性下降，但其具体机制尚不明确。SERCA在维持Ca2+稳态中起关键作用，并可通过下游多个通路诱导细胞凋亡，其抑制与否对细胞的生死决策有重要的影响［10］。多种天然药物提取物抗癌作用的靶点也被证实为SERCA，如金丝桃素［11］、姜黄素［12］等。DHA亦可调控细胞内质网和细胞质Ca2+失衡，引起内质网应激反应诱导细胞凋亡［13-14］，因此，DHA可能也是通过作用于SERCA，诱导结肠癌细胞凋亡，具体机制有待阐明。本研究首次采用LeDock分子对接方法及生物膜干涉技术，预测并证实DHA与SERCA2b的结合及其结合位点，揭示了DHA通过线粒体途径诱导结肠癌HCT-116细胞凋亡。
1.1 细胞及处理
人结肠癌细胞HCT-116购自中国科学院上海细胞库。用含10%胎牛血清（美国Hyclone公司）、1%青链霉素的McCoy’s 5A培养基（美国Gibco公司），在37℃、5%CO2培养箱中培养。常规换液、传代。当细胞生长至80%～90%，分别加入不同浓度（10、20、40 μmol/L）DHA处理，并设置DMSO处理的对照组。
1.2 方法
1.2.1 SERCA活性检测：通过差速离心提取微粒体蛋白质。用BCA试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）测定蛋白浓度，根据SERCA活性检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）说明书检测SERCA活性，1 h后酶标仪读取600 nm光密度值。每个点重复检测3次。SERCA活性以每毫克微粒体蛋白每小时产生无机磷酸盐的量表示。
1.2.2 Western blotting检测：通过细胞裂解液（上海碧云天生物技术有限公司）裂解提取总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，上等量蛋白样品行SDSPAGE凝胶电泳，电转移至PVDF膜（美国Millipore公司）。室温条件下，用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜1 h，加入小鼠SERCA2单克隆抗体（sc-376235，美国Santa Cruz Biotechnology公司）4℃孵育过夜。洗膜后，用二抗辣根过氧化物酶标记的抗鼠IgG抗体37℃孵育45 min。采用ECL试剂盒（美国Millipore公司）显像。β-actin和COX-Ⅳ作内参照。
1.2.3 流式细胞仪检测：按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）说明书检测。分别将HCT-116细胞培养于含0、10、20、40 μmol/L DHA的培养基中24 h。用胰酶消化细胞，待细胞变圆脱落后，加入完全培养基终止消化，PBS洗涤2次，并进行细胞计数。加入500 μL Binding buffer重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI混匀，室温避光反应15 min。行流式细胞仪检测，通过FL1检测Annexin V-FITC，FL2检测PI。
1.2.4 细胞增殖检测：用CCK-8检测试剂盒分析细胞增殖情况。将细胞按2×104/孔接种至96孔板中，分别用不同浓度DHA（10、20、40 μmol/L）处理。每孔加入 CCK-8试剂10 μL，37℃孵育1 h。用酶标仪检测450 nm处吸光度值。
1.2.5 Hoechst核染色：将细胞接种至12孔板，待生长至亚融合状态后，用10、20、40 μmol/L DHA处理，37℃培养24 h后，用Hoechst33342染色，荧光显微镜下观测细胞凋亡。
1.2.6 线粒体膜电位检测：在0～6 h时分别用40 μmol/L DHA处理HCT-116细胞，然后用1 mg/mL JC-1探针（江苏凯基生物技术股份有限公司）37℃避光孵育15 min。细胞洗涤后，通过IX73显微镜观察。通过流式细胞仪在530 nm（FL1通道）和590 nm（FL2通道）检测荧光强度，通过红色荧光（FL2通道）与绿色荧光（FL1通道）的比值计算线粒体膜电位（ΔΨ）。
1.2.7 DHA与SERCA2b相互作用位点的预测：根据PDB数据库（https：//www.rcsb.org/）信息，蛋白质SERCA2b的PDB ID为6LN6。使用LeDock软件（http：//www.lephar.com/index.htm）进行互作位点预测。每个结合位点生成100个构象，以RMSD=1.0 Å进行聚类，其他参数默认设置。对接结果选择结合能最低的构象，然后选择结合能最低的构象，用PLIP和PyMOL进行结合位点的分析。
1.2.8 SERCA2b（314-756aa）野生型及突变体的重组蛋白表达：为了达到位点研究的目的，对预测的位点进行突变，将SERCA2b（314-756aa）突变体的氨基酸Ile315和Thr316突变为对蛋白功能及结构影响较小的丙氨酸［8］。为成功表达SERCA2b（314-756aa）野生型及突变体蛋白，利用基因合成技术合成了SERCA2b（314-756aa）野生型及突变体基因，插入his标签，将2段基因分别连接到pET30a表达载体。利用大肠杆菌表达体系对2种蛋白分别进行表达。表达成功后，利用镍柱对2种重组蛋白进行纯化。对纯化后的蛋白进行复性，并进行SDS-PAGE检测，确定其浓度和纯度。
1.2.9 SERCA2b（314-756aa）野生型及突变体与DHA结合的检测：利用生物膜干涉技术分别检测SERCA2b（314-756aa）野生型及突变体与DHA之间的结合。拟合模型选择1∶1，即1个重组蛋白结合1个小分子DHA，拟合方式global，即把5个浓度作为1组关联进行分析。
1.3 统计学分析
采用Data Analysis software 9.0进行统计学分析，计量资料用±s表示，采用Student’st检验比较组间差异。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 DHA抑制SERCA活性的同时降低SERCA2蛋白的表达水平
用不同浓度DHA（0、10、20、40 μmol/L）处理HCT-116细胞24 h，结果显示，细胞中SERCA活性减弱（图1A）；
Western blotting结果显示，0、10、20 μmol/L DHA不影响SERCA2蛋白表达，而40 μmol/L DHA明显抑制了SERCA2蛋白表达（图1B）。提示高浓度DHA可影响HCT-116细胞中SERCA2蛋白的表达。
A，SERCA activity is determined by the amount of inorganic phosphate produced per hour per milligram of microsomal protein；
B，Western blotting measured SERCA2 protein levels and quantified them by density values，β-actin as an internal reference，and the data were expressed as ±s deviation of three independent replicates.*P＜0.05 vs.0 μmol·L-1 DHA.图1 DHA抑制HCT-116细胞SERCA活性及其蛋白表达水平Fig.1 DHA inhibits SERCA activity and reduces the expression of SERCA2 protein in HCT-116 cells
2.2 DHA通过抑制SERCA活性抑制HCT-116细胞增殖
CCK-8检测结果显示，DHA处理48～72 h后，HCT-116细胞增殖活性显著降低，并呈剂量相关性（P＜0.01）（图2A）。Hoechst核染色显示，与对照组相比，DHA诱导HCT-116细胞膜通透性增加，细胞核变圆、固缩，染色质凝缩，即出现凋亡细胞特征（图2B）。
A，after exposed to progressively increasing concentrations（0，10，20，40 μmol/L）of DHA，HCT-116 cell viability was assessed using CCK-8.*P＜0.01 vs.0 μmol/L DHA after 48 h treatment，**P＜0.01 vs.0 μmol/L DHA after 72 h treatment；
B，after co-incubating HCT116 cells with different concentrations of DHA for 24 h，Hoechst 33342 staining was performed and observed by fluorescence microscopy to detect apoptosis（×10）.Arrows indicate apoptotic cells.图2 DHA诱导的抗增殖及促凋亡作用Fig.2 DHA-induced antiproliferative and pro-apoptosis effects
2.3 DHA诱导细胞线粒体膜电位降低
JC-1的单体形式发绿色荧光，而在膜极化的线粒体中形成聚合体（即线粒体膜电位增加），并发红色荧光。用DHA处理HCT-116细胞，随着时间推移，细胞内红色荧光消失（图3A），提示线粒体膜电位下降。流式细胞分析结果显示，在DHA处理的最初数小时内，线粒体膜电位稍下降，而在5 h后，超过半数细胞线粒体膜电位明显下降（图3B）。
A，fluorescence microscopy（×10）；
B，analysis of results，data expressed as ±s deviation of three independent replicates.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with 0 h.图3 DHA诱导线粒体膜电位下降Fig.3 DHA-induced decrease in mitochondrial membrane potential
2.4 SERCA2b与DHA相互作用位点的预测
通过软件对最小结合能构象进行分析，发现DHA与SERCA2b的Arg246、Gln250、Thr316形成氢键相互作用，与Glu58、Asp59、Pro312和Ile315有疏水相互作用。预测DHA和SERCA之间的结合模式见图4。
图4 DHA和SERCA之间结合模式的预测Fig.4 Predicted binding patterns between dihydroartemisinin and SERCA
2.5 SERCA2b（314-756aa）野生型及突变体的重组蛋白表达
用最大的非跨膜相aa314-756对SERCA2b蛋白进行相互作用位点研究，结果显示，SERCA2b（314-756aa）包含了Thr316和Ile315这2个结合位点，因此，以Thr316和Ile315为预测结合位点进行突变研究。在SERCA2b（314-756aa）的突变体中，为了避免干扰蛋白质结构，将Thr316和Ile315突变成为丙氨酸（图5）。
M，marker；
1，SERCA2b（314-756aa）wild-type protein recombinant protein；
2，SERCA2b（314-756aa）mutant recombinant protein.图5 蛋白质质量表达纯化凝胶图Fig.5 Protein mass expression purification gel diagram
2.6 SERCA2b（314-756aa）野生型及突变体与DHA之间的结合检测结果
首先，检测SERCA2b（314-756aa）野生型与DHA之间的结合。结果如图6A所示，随着分析物浓度的增加，结果相应增加，即呈显著正相关，表明SERCA2b（314-756aa）野生型蛋白和小分子DHA之间存在相互作用。然后，检测了SERCA2b（314-756aa）突变体与DHA之间的结合。结果如图6B所示，随着分析物浓度的增加，结果未显示相关性，意味着SERCA2b（314-756aa）突变体蛋白和小分子DHA之间无相互作用。证明Thr316和Ile315有可能是SERCA2b（314-756aa）与小分子DHA之间相互结合的关键性氨基酸位点。
A，interaction between wild-type SERCA2b and dihydroartemisinin；
B，interaction between mutant SERCA2b and dihydroartemisinin.图6 SERCA2b和DHA之间的相互作用Fig.6 Interaction between SERCA2b and dihydroartemisinin
DHA可抑制多种肿瘤细胞的增殖，促进细胞凋亡。研究［9］表明，DHA可抑制SERCA2b，导致肿瘤细胞内质网中Ca2+紊乱，从而通过内质网、线粒体、死亡受体等多种途径诱导细胞凋亡。
为探讨DHA在HCT-116细胞线粒体途径凋亡中的作用，本研究首先使用流式细胞仪检测DHA处理后HCT-116细胞的凋亡情况，并通过Western blotting检测SERCA2b蛋白的表达。结果发现，DHA抑制了SERCA2b活性并降低了SERCA2b蛋白的表达水平，促进了HCT-116细胞凋亡，且与浓度呈正相关。
为了阐明线粒体参与DHA诱导的结肠癌细胞凋亡机制，本研究检测了DHA处理后线粒体膜电位的变化，发现DHA作用细胞5 h时线粒体膜电位急剧下降。说明线粒体功能障碍是DHA诱导结肠癌细胞凋亡的机制之一。DHA诱导的线粒体膜电位降低发生在DHA暴露后相对较早的时期。本研究还发现线粒体功能紊乱在DHA促进HCT-116细胞的凋亡中起关键作用。线粒体通路是典型的细胞凋亡通路。线粒体膜电位丧失导致细胞色素c从线粒体内释放至细胞质中，激活caspase-8和caspase-9，进而激活细胞凋亡的执行者caspase-3［15］。前期研究［16］发现，DHA可能导致HCT-116细胞线粒体膜电位崩溃，释放细胞色素c，增加Bax/Bcl2比率，激活caspas-3、caspas-8和caspas-9，证明线粒体参与了DHA诱导的结肠癌细胞的凋亡。
SERCA包含3种亚型，通过水解ATP，将细胞质中Ca2+转移至内质网腔内［17］。结肠癌细胞调控Ca2+平衡的主要是SERCA2b。SERCA2b是一种多跨膜蛋白，很难在体外表达［6］，这也限制了DHA与SERCA具体结合位点的研究。为进一步确定DHA调控SERCA2b活性的靶点，本研究选取SERCA2b最长的一段Topological domain（314-756aa），该段属于细胞质区域。首先，应用生物膜干涉技术［7］检测并确认了SERCA2b和DHA间的结合。其次，应用LeDock分子对接方法预测DHA与SERCA 的结合位点［8，12］，发现处于314-756aa段的Ile315和Thr316是可能的结合位点。进一步对Ile315和Thr316进行丙氨酸位点突变并表达突变蛋白，再次通过Octet 平台基于生物膜干涉技术［9-11］，对合成的Ile315与Thr316位点突变后的SERCA2b突变蛋白和非突变蛋白分别与小分子DHA进行结合检测，结果证实突变型SERCA2b与DHA之间无相互作用，提示DHA可与SERCA2b的Ile315和Thr316位点直接结合。
综上所述，本研究结果显示，DHA可直接结合SERCA2b的Ile315和Thr316位点，通过增加HCT-116细胞内Ca2+浓度，导致Ca2+紊乱，继而通过线粒体途径诱导细胞凋亡。未来将尝试合成SERCA2b全蛋白，并进一步明确SERCA2b与DHA的全部结合位点及其上下游调控机制，以期为DHA抗肿瘤研究提供新思路，开辟新途径。
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