陈肖瑜,罗文奇,张凤友,蒋芳诚,莫濡蔚,党裔武
肾细胞癌包括三种主要的组织学亚型：透明细胞肾细胞癌(clear cell renal cell cancer, CCRCC)、乳头状肾细胞癌和嫌色肾细胞癌。CCRCC起源于肾小管上皮系统,形态具有异质性,是肾细胞癌最常见的类型,占肾细胞癌的70%。早中期CCRCC首选手术治疗,早期术后5年生存率约70%,约30%患者术后3～5年内复发[1]。局部复发或转移性CCRCC患者的预后较差。晚期CCRCC患者的最佳治疗方案是免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitor, ICI)联合酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor, TKI),但CCRCC异常糖酵解信号可促进肿瘤细胞形成抑制性免疫微环境,介导肿瘤免疫逃逸,从而影响免疫治疗的效果[2]。恶性肿瘤的代谢重排是继免疫治疗后的又一研究热点。人神经元特异性γ-烯醇酶2(enolase 2, ENO2),又称神经元特异性烯醇化酶(neuron-specificenolase, NSE),它在糖酵解中起重要的作用,在促进β-甘油磷酸酯转化为二羟磷酸丙酮的同时,形成腺苷三磷酸(ATP)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH),促进肿瘤细胞的增殖和侵袭[3]。目前有文献报道ENO2作为癌基因可促进CCRCC的进展[4-5],本实验通过免疫组化法对97例CCRCC组织进行分析,验证其表达情况及诊断价值,初探其促进CCRCC发展的潜在分子机制。
1.1 材料收集2018年5月～2023年5月广西医科大学附属肿瘤医院存档的97例CCRCC和对应正常肾组织石蜡标本,纳入标准：(1)术前均未行放、化疗或分子靶向治疗;(2)近5年内的根治术标本;(3)经广西医科大学附属肿瘤医院医学伦理委员会审批;(4)所有病例均经副主任医师以上职称病理专家审核确诊。
1.2 方法
1.2.1免疫组化 采用免疫组化MaxVision法检测ENO2(货号MAB-0791,福州迈新公司,稀释1∶100)蛋白的表达。实验步骤严格按试剂盒说明书操作,采用柠檬酸高压修复法。结果判读：(1)按阳性细胞百分比评分：阳性细胞数<5%为0分,6%～25%为1分,26%～50%为2分,51%～75%为3分,76%～100%为4分。(2)按阳性细胞染色强度评分：无阳性着色为0分,呈浅黄色为1分,黄色或棕黄色为2分,深黄色或黄褐色为3分。将两项评分相乘得到最终评分：>3分为高表达,≤3分为低表达。
1.2.2公共数据提取 从肿瘤基因组图谱(the Cancer Genome Atlas, TCGA)(https：//portal.gdc.cancer.gov)获得542例CCRCC和72例正常肾组织mRNA测序数据,获得ENO2 mRNA在CCRCC及正常组织中的表达水平。GEPIA数据库(http：//gepia.cancer-pku.cn/)储存了来自TCGA数据库的516例CCRCC的高通量测序数据以及对应的生存资料,根据516例CCRCC中ENO2 mRNA表达量的中位数分为ENO2高表达组和ENO2低表达组,利用GEPIA工具进行生存分析,以探究ENO2表达与CCRCC患者预后的关系。使用TIMER在线数据(https：//cistrome.shinyapps.io/timer/)分析ENO2的表达与糖代谢路径关键基因的相关性。
1.3 统计学方法采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。χ2检验分析ENO2蛋白表达与临床病理特征的关系。独立样本t检验分析ENO2 mRNA表达在CCRCC组和对照正常组间的差异。ROC曲线分析ENO2在CCRCC中表达的敏感性和特异性。Log-rank检验TCGA数据库516例CCRCC中ENO2高表达组和低表达组间的总生存期与预后的关系。
2.1 CCRCC中ENO2蛋白和mRNA水平利用免疫组化法检测97例CCRCC及配对正常肾石蜡包埋组织中ENO2蛋白的表达,ENO2蛋白定位于细胞质(图1)。免疫组化结果统计发现,ENO2蛋白在CCRCC组织中的高表达率为71.13%(69/97),而在正常肾组织中均未见表达。ENO2蛋白在CCRCC组织的表达显著高于正常肾组织,差异有统计学意义(P<0.001)。应用TCGA-CCRCC数据库分析ENO2 mRNA的表达水平,结果显示,与正常对照肾组织相比,CCRCC中ENO2 mRNA表达均显著上调(P<0.001,图2)。
图1 A.正常肾组织HE染色;B.透明细胞肾细胞癌组织HE染色;C.正常肾组织中ENO2蛋白呈阴性,MaxVision法;D.透明细胞肾细胞癌组织ENO2蛋白呈弱阳性,MaxVision法;E.透明细胞肾细胞癌组织ENO2蛋白呈中等阳性,MaxVision法;F.透明细胞肾细胞癌组织ENO2蛋白呈强阳性,MaxVision法
图2 A. 97例根治术标本透明细胞肾细胞癌组织和对应的正常肾组织中ENO2蛋白的表达;B.TCGA数据库透明细胞肾细胞癌组织和正常肾组织中ENO2 mRNA的表达
2.2 ENO2蛋白表达与CCRCC临床病理特征的关系ENO2蛋白表达与ISUP/WHO分级(P=0.019)、有无肾周脂肪侵犯(P=0.028)密切相关(表1),而与患者年龄、性别、肿物大小、病理分期、有无癌栓均无关(P>0.05)。
表1 ENO2蛋白表达与透明细胞肾细胞癌临床病理特征的关系
2.3 ROC曲线分析ENO2在CCRCC中的敏感性和特异性应用TCGA数据库中542例CCRCC和72例正常肾组织的ENO2 mRNA表达量及97例CCRCC根治术标本和对应的正常肾组织ENO2蛋白表达量作ROC曲线分析。ROC曲线提示：CCRCC中ENO2 mRNA(95%CI为0.941～0.978,AUC=0.959,P<0.001,图3A)以及ENO2蛋白的表达(95%CI为0.934～0.994,AUC=0.964,P<0.001,图3B)具有较高的敏感性和特异性,对CCRCC具有较高的诊断价值。
图3 A. TCGA数据库542例透明细胞肾细胞癌和72例正常肾组织的ENO2 mRNA表达量的ROC曲线;B.97例透明细胞肾细胞癌根治术标本和对应的正常肾组织ENO2蛋白表达量的ROC曲线
2.4 TCGA数据库516例CCRCC的高通量测序数据及生存分析通过GEPIA在线网站分析ENO2与CCRCC患者预后的关系,其中ENO2 mRNA高表达组与低表达组样本各258例,生存分析结果提示,ENO2 mRNA高表达组患者的总生存期(overall survival, OS)显著低于低表达组,ENO2 mRNA高表达CCRCC患者具有更差的预后,OS更低(P=0.019,图4)。
2.5 ENO2与糖代谢路径相关基因的关系本组通过TIMER在线分析ENO2 mRNA表达与糖代谢路径相关基因的关系,Peason相关性分析提示：ENO2 mRNA与糖代谢路径相关基因HK2(R=0.346,P=1.81e-16)、ALDOA(R=0.201,P=2.92e-06)、PGK1(R=0.325,P=1.35e-14)、PKM2(R=0.203,P=2.34e-06)及LDHA(R=0.238,P=2.70e-08)的表达呈正相关(图5)。
图5 ENO2 mRNA与糖代谢路径关键相关基因的关系
CCRCC在泌尿系统中是常见的致死性疾病,全球每年新增约40.3万肾细胞癌新发病例和17.5万死亡病例[6]。晚期CCRCC患者的预后不佳,5年生存率大幅度下降。CCRCC糖酵解代谢异常活跃[7],被认为是一种代谢性疾病,涉及糖酵解、三羧酸循环、磷酸戊糖旁路、脂肪酸和氨基酸代谢通路的广泛改变[8]。肥胖和糖尿病成为CCRCC发病的危险因素,通过糖酵解调控联合免疫或靶向治疗的方案将成为现有CCRCC治疗的重要补充,从而改变晚期CCRCC治疗现状[2]。ENO2是一种长链酸性二聚体蛋白,含433个氨基酸,通常在成熟神经元和神经元来源的细胞中表达,是肿瘤中神经内分泌分化的常见标志物[9-10]。此外,它也在红细胞、血小板、乳腺组织、前列腺和子宫组织中表达[11-12]。
据报道,ENO2在胶质瘤、胃癌、前列腺癌和许多其他类型的恶性肿瘤中表达上调[13-15]。在急性淋巴细胞白血病中ENO2能促进肿瘤细胞的增殖[16],在胶质母细胞瘤中,ENO2表达较高的患者OS明显低于ENO2表达较低的患者,敲除ENO2能显著抑制胶质母细胞瘤细胞的迁移[15]。本研究通过免疫组化检测了97例CCRCC根治术标本和对应正常肾组织中ENO2蛋白的表达,结果显示ENO2蛋白在正常肾组织中几乎不表达,而在CCRCC中明显高表达,并且具有较高的敏感性和特异性,对CCRCC和正常肾组织具有较好的区分能力,是一个潜在的CCRCC的鉴别诊断标志物。文献报道ENO2也是小细胞肺癌诊断、预后和随访中可靠的肿瘤标志物[11]。分析TCGA数据库中516例CCRCC的高通量测序数据以及对应的生存资料,结果显示ENO2基因高表达组具有更差的预后,因此检测ENO2蛋白对预测CCRCC患者生存有一定的指导价值[17],有望成为CCRCC患者的独立预后因素。有研究发现,ENO2在CCRCC组织中高表达,并在激活细胞周期、EMT和PI3K/AKT信号通路中发挥作用[18-19]。同时,ENO2可能通过糖酵解促进CCRCC细胞的生长和侵袭,其中糖酵解/糖异生已经被证实与CCRCC的发病密切相关[20],而ENO2高表达可能与Warburg效应有关,提示ENO2参与促进CCRCC的发生、发展。TIMER分析ENO2与糖代谢路径相关基因HK2、ALDOA、PGK、PKM2及LDHA的表达呈正相关,ENO2可促进肿瘤细胞糖酵解,满足肿瘤细胞的能量代谢并促进增殖。通过调节晚期CCRCC患者的ENO2表达,控制糖酵解进程,促进肿瘤的免疫微环境形成,阻碍肿瘤细胞逃逸,再对其进行免疫治疗或靶向治疗,或许能取得更好的治疗效果。最新研究[21]表明,ENO2高表达的结直肠癌患者对抗血管生成治疗反应较差,由于ENO2衍生的磷酸烯醇丙酮酸作为内源性HDAC1抑制剂发挥作用,并对抗血管生成治疗产生抗性。有效抑制ENO2或代谢相关基因的活性,可能给代谢重排和抗血管治疗CCRCC患者提供新的机会。
综上,本实验基于免疫组化及TCGA、GEO、TIMER等数据库分析,研究ENO2在CCRCC中的作用及潜在分子机制,丰富了ENO2在肾脏肿瘤中的研究理论依据,ENO2有望成为CCRCC潜在的诊疗及预后判断的生物学标志物。
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