潘虹婷，王超，朱鲜，侯强
1.温州医科大学 检验医学院（生命科学学院），浙江 温州 325035；
2.温州医科大学附属眼视光医院 眼视光学和视觉科学国家重点实验室，浙江 温州 325027；
3.琼海市人民医院 药学部，海南 琼海 571400
葡萄膜黑色素瘤（uveal melanoma, UM）是成人眼内最常见的原发性恶性肿瘤[1]，起源于眼睛中的痣细胞和黑色素细胞[2]，发生于脉络膜（90%）、睫状体（6%）和虹膜（4%），具有高度侵袭性和转移倾向[3]。危险因素包括白色皮肤、浅色的眼睛、先天性眼部黑色素细胞增多症、眼部黑色素痣和BAP1-肿瘤易感综合征[4]。近年来越来越多的microRNA（miRNA）被发现与UM异常的信号通路有关，在细胞增殖、凋亡、血管生成、EMT和肿瘤侵袭中起着重要而又复杂的作用[5]，提示miRNA在UM致病机制中扮演着重要角色。miR-29家族包括miR-29a、miR-29b和miR-29c[6]在白血病、乳腺癌、肝癌等癌症中可以参与调控蛋白稳态、代谢、增殖、细胞周期、凋亡、转移、侵袭、纤维化、血管生成和免疫调节等多种致癌过程[7-8]。但miR-29家族在UM中的作用还不清楚。本研究将外源性的hsa-miR-29a/b/c或阴性对照（negative control, NC）转染进UM细胞中，研究其对UM细胞增殖和侵袭能力的影响，随后进行下游靶标寻找，并探索其对UM功能的影响，从而初步阐明miR-29a/b/c在UM发挥的作用。
1.1 材料
1.1.1 细胞 人UM细胞系M23和SP6.5获赠于加拿大魁北克免疫研究中心，均分离提取自高加索患者原发性脉络膜黑色素瘤，培养于含有10% FBS的DMEM完全培养基内，置于37 ℃、5% CO2培养箱内培养。
1.1.2 主要药物和试剂 DMEM培养基和FBS购自美国Gibco公司；
Transwell小室购自美国Costar公司；
Matrigel侵袭胶购自美国BD Biosciences公司；
HGF购自美国R＆D Systems公司；
SDS裂解液、免疫染色固定液和结晶紫染色液购自上海碧云天生物技术有限公司；
Pierce BCA蛋白浓度测定试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司；
ELISA试剂盒购自英国Abcam公司；
Lipofectamine 2000、Trizol reagent购自美国Invitrogen公司；
转染所用小片段购自上海吉玛公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞转染 将细胞按照10%密度接种于培养板内，隔天使用Lipofectamine 2000将外源性miRNA或siRNA转入细胞。小片段对应序列为：hsamiR-29a（5’-UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA-3’和5’-ACCG AUUUCAGAUGGUGCUAUU-3’），hsa-miR-29b（5’-UAGCACC AUUUGAAAUCAGUGUU-3’和5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUA UU-3’），hsa-miR-29c（5’-UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA-3’和5’-ACCGAUUUCAAAUGGUGCUAUU-3’），NC（5’-UUCUC CGAACGUGUCACGUTT-3’和5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAT T-3’），siMMP2（5’-GGAGAGCUGCAACCUGUUU-3’和5’-ACAGGUUGCAGCUCUCCUU-3’）。
1.2.2 细胞增殖实验 将细胞接种于96 孔板中，每孔接种1 200个细胞，接种24 h后进行分组转染处理，组别分别为未处理的mock组、转染阴性对照的NC组和转染目的基因的miR-29a组、miR-29b组、miR-29c组。于转染后的第1、2、3、4、5天进行检测，检测时在测定孔内加入20 μL MTS混合液（MTS：PMS=20:1）后在培养箱内孵育2 h，使用Spectra Max M5型酶标仪（美国Molecular Devices公司）测定490 nm波长下的吸光度。
1.2.3 Matrigel Transwell实验 在Transwell小室的上室中加入40 μL Matrigel侵袭胶，放置于培养箱至侵袭胶凝固。将转染48 h后的细胞消化重悬至细胞浓度为3×105个/mL，在铺好胶的上室中加入200 μL细胞悬液，下室加入600 μL含100 ng/mL HGF的DMEM培养基后放置于培养箱过夜。第2天取出小室，使用免疫染色固定液固定、结晶紫溶液染色、清洗、晾干，于显微镜下随机选取5个视野拍照并进行计数（细胞进行分组转染，研究miR-29a/b/c 对UM细胞侵袭能力的影响时，将组别分为未处理的mock组、转染阴性对照的NC组和转染目的基因的miR-29a组、miR-29b组、miR-29c组；
研究基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2, MMP2）对UM细胞侵袭能力的影响时，将组别分为未处理的mock组、转染阴性对照的NC组和转染MMP2 特异性siRNA的siMMP2组）。
1.2.4 ELISA实验 将细胞接种于12孔板内，隔天换成无FBS的DMEM培养基进行分组转染，组别设置为转染阴性对照的NC组和转染目的基因的miR-29a组、miR-29b组、miR-29c组。转染72 h时，收集细胞培养上清液。同时使用等量SDS裂解液提取细胞总蛋白，随后使用Pierce BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总样本蛋白浓度以矫正细胞上清液浓度。提前取出ELISA试剂及上清液样品于常温复温，每孔中加入50 μL上清液样品或标准品，按照ELISA试剂盒说明书操作，最后使用酶标仪测定540 nm和450 nm波长下的吸光度，计算样品中MMP2的蛋白浓度。
1.2.5 PCR检测 使用TRIzol reagent从转染阴性对照的NC组和转染目的基因的miR-29a组、miR-29b组、miR-29c组UM细胞中提取总RNA，取1 μg反转录为cDNA，再进行PCR扩增，将产物进行电泳，使用GelDoc XR凝胶成像系统（美国BIO-RAD公司）拍照。引物对应序列为：MMP2：Forward 5’-CTCAGATCCGTGG TGAGATCT-3’，Reverse 5’-CTTTGGTTCTCCAGCTTCAGG-3’；
GAPDH：Forward 5’-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTT GGT-3’，Reverse 5’-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3’。
1.3 统计学处理方法
采用SPSS25.0进行分析。正态分布的计量资料以±s表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较使用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 转染miR-29a/b/c抑制UM细胞的增殖能力
首先进行MTS实验检测转染miR-29a/b/c对UM细胞增殖能力的影响。结果发现，转染2 d后，miR-29a/b/c对细胞增殖没有明显影响。第3天时，转染miR-29a/b/c组与对照组相比，细胞增殖能力减弱，差异有统计学意义（P＜0.05）。随着时间推移，组间差异越来越明显（P＜0.05）。这表明miR-29a/b/c均能抑制UM细胞的增殖能力。见图1。
图1 转染miR-29a/b/c对M23和SP6.5增殖的影响
2.2 转染miR-29a/b/c抑制UM细胞的侵袭能力
确定miR-29a/b/c抑制UM细胞增殖能力后，我们进一步通过Matrigel Transwell实验检测miR-29a/b/c是否可以调节UM细胞的侵袭能力，结果显示，转染阴性对照对细胞侵袭没有显著影响，且与NC组比，miR-29a/b/c组侵袭到下室的细胞数目明显减少（P＜0.05）。这表明miR-29a/b/c可以抑制UM细胞的侵袭能力。见图2。
图2 Matrigel Transwell实验检测转染miR-29a/b/c对M23和SP6.5细胞侵袭能力的影响（×200）
2.3 MMP2是miR-29a/b/c直接作用的靶基因
图3 转染miR-29a/b/c对M23和SP6.5细胞MMP2 mRNA转录和蛋白分泌的影响
图4 转染MMP2特异性siRNA对M23和SP6.5细胞侵袭能力的影响
证实miR-29a/b/c抑制UM细胞的侵袭能力后，提取UM的总RNA进行MMP2 mRNA表达量检测，收集UM的培养上清进行MMP2蛋白水平表达量的检测，其中ELISA实验结果使用收取上清液时的细胞全蛋白浓度进行矫正。结果发现，虽然在转染miR-29a/b/c后UM MMP2的mRNA没有变化，但是miR-29a/b/c组与对照组相比，MMP2 蛋白分泌量出现了下降（P＜0.05）。这提示，转染miR-29a/b/c抑制UM细胞分泌MMP2，但不影响MMP2 mRNA转录。见图3。
2.4 MMP2调控UM的侵袭能力
课题组前期研究[9]已证实MMP2参与调节SP6.5细胞的侵袭能力，为了进一步验证MMP2对UM侵袭能力的影响，我们干扰M23中的MMP2后进行Matrigel Transwell实验。结果显示，在下调MMP2 表达后，UM的侵袭能力显著下降（P＜0.05）。见图4。
UM是成人眼内最常见的侵略性恶性肿瘤[10]，目前临床上主要采用局部巩膜外敷贴放射疗法和眼球摘除法[11]治疗。经过治疗，原发灶能够得到有效的控制，但仍有50%的患者会发生肝转移，转移后存活率很低，通常在一年内死亡[4]。到目前为止，对于UM转移性疾病还没有预防或治疗的标准策略，UM的临床治疗仍然是个巨大的难点。
MicroRNAs是一类单链非编码RNA分子，在转录后负调控靶基因mRNA表达[12]，于各种生理和病理过程中发挥着重要作用，拥有作为肿瘤诊断和治疗药物的巨大潜力。其中，MiR-29家族作为眼部发育的主要调节因子之一[13-16]，引起了我们的关注。miR-29已在乳腺癌[17]、胃癌[18]、肝癌[19]等中被证实作为抑癌因子，在癌症的发展过程中发挥着重要作用，而在UM中的功能鲜见报道。
为了进一步探索miR-29对UM细胞功能的影响，本研究通过加入外源性miR-29a/b/c，进行细胞功能变化检测，结果显示，转染miR-29a/b/c均能抑制UM细胞的增殖和侵袭功能，这表明miR-29家族可能参与了UM的发生和发展过程。
MMP2为基质金属蛋白酶家族中的一员，是一种分泌型蛋白，能够降解IV型胶原蛋白进而影响基底膜的完整性[20]并调节细胞活动[21]，有助于细胞间连接的解体和细胞外基质的降解，从而克服细胞运动的物理限制，进而参与肿瘤侵袭活动，是抗肿瘤药物的重要靶标[22-23]。先前已有文献报道MMP2在胰腺癌、肝癌、结直肠癌等中是miR-29的直接靶基因[24]，但其关系在UM中鲜有报道。为了进一步确认MMP2与miR-29 家族在UM细胞中的关系，本研究采用了半定量PCR和ELISA实验进行验证。结果显示UM细胞在转染miR-29a/b/c后，其细胞培养上清液中的MMP2蛋白含量明显下降而对MMP2 mRNA的表达没有影响。因此，我们认为MMP2 在蛋白水平是miR-29的直接靶标。我们之前研究发现干扰MMP2在SP6.5细胞系中能够抑制细胞的侵袭功能[11]，在这里我们进一步检测了MMP2对M23细胞侵袭功能的影响。结果显示，在M23中，干扰MMP2同样可以抑制细胞的侵袭能力。这些结果证明miR-29a/b/c可以通过抑制MMP2调控UM细胞的侵袭能力。
综上，本研究在UM细胞中探索miR-29家族对细胞功能的影响，证实了miR-29a/b/c可以抑制UM细胞的增殖和侵袭功能，并证明了miR-29在UM细胞中可以通过抑制MMP2调控UM细胞的侵袭能力，这有助于进一步了解UM的疾病机制，为UM治疗靶标的寻找提供了新方向。
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