杨 璐,杨 桦△,张亚快,陈大力
1.宁夏医科大学,宁夏 银川 750000; 2.银川市中医医院,宁夏 银川 750000;3.宁夏回族自治区戒毒管理局,宁夏 银川 750000
海洛因依赖是一种复杂的慢性脑疾病[1],由于滥用海洛因等,世界上许多国家目前正在经历一场公共卫生危机[2]。据中国国家禁毒委员会办公室在2023年6月21日发布的《2022年中国毒情形势报告》显示,截至2022年底全国现有吸毒人员112.4万名,其中,滥用海洛因41.6万名,占总吸毒人员37%。戒毒已经被大众所关注。海洛因依赖者在急性戒断期后,在相当长的时间内会出现焦虑、抑郁、失眠、便秘及疼痛等稽延性戒断症状,这也是导致复吸的重要原因,不利于彻底脱毒[3]。现有研究[4-5]指出肠道菌群与宿主的成瘾行为密切相关,对中枢神经系统的影响及作用不容忽视。针灸可以影响肠道菌群,而肠道菌群分泌的脑肠肽对海洛因稽延性戒断症状具有调控作用[3]。因此,本研究采用高通量16SrDNA测序技术观察穴位埋线疗法对海洛因依赖者稽延性戒断症状的改善作用,并通过观察干预前后海洛因依赖者肠道微生物群落结构的改变,对稽延性戒断症状特定菌群结构或专属优势菌进行探索,以期为推动毒瘾医学的创新发展做出贡献。
1.1 一般资料
本研究按照自愿原则选取30名宁夏回族自治区某强制隔离戒毒所的稽延期海洛因依赖患者,随机分成对照组(CG)和穴位埋线组(TG),每组各15例。本研究获得宁夏医科大学医学伦理委员会批准(伦理批件号:2021-G153)。
两组受试者一般资料比较,对照组和穴位埋线组年龄、受教育年限、海洛因日吸毒量、海洛因吸毒时间与海洛因滥用方式比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
表1 两组受试者一般资料比较
1.2 诊断标准
符合国际疾病分类第10版《ICD-10精神与行为障碍分类》中阿片类药物依赖诊断标准[6]。
1.3 纳入标准
①符合阿片类药物依赖诊断标准;②年龄在30～60岁之间;③脱毒后尿吗啡试验阴性;④遗留有明显稽延性戒断症状者;⑤所有受试者均签署知情同意书。
1.4 排除标准
①有严重心、肝、肾功能损害和重度精神疾患者;②有严重感染疾病者;③严重消化系统疾病者;④近1个月内有使用微生态调节剂或胃动力药物,近2周内有使用中药制剂或抗生素者。
2.1 对照组
被试者在接下来的2个月内不接受针刺治疗,按照强制隔离戒毒所正常的管理模式进行管教。
2.2 穴位埋线组
被试者在强制隔离戒毒所正常管理模式下,进行穴位埋线治疗。穴位选取:百会、曲池、天枢、关元、足三里、三阴交及心俞。操作:穴位皮肤严格消毒,将一次性使用埋线针0.6 mm×60 mm穿入可吸收性外科缝线[4-0#,2 cm×12 cm(三阴交用1 cm长的线)],刺入穴位,得气后推进针芯,使线留在穴位内,然后将埋线针快速退出皮面,局部用干棉球压迫片刻,以防出血,最后在埋线处贴上医用胶贴,以防感染。曲池、天枢、关元、足三里及三阴交均直刺15 mm,百会平刺15 mm,心俞向脊柱方向斜刺10 mm。每2周治疗1次,共治疗2个月。穴位埋线操作均由3名经统一严格培训的针灸专科医生进行。
3.1 观察指标
3.1.1 海洛因稽延性戒断症状评定量表 分别在治疗前1 d与治疗后2个月对所有受试者进行量表评分,该量表共19个条目,分为4个因子:躯体症状、情绪症状、渴求症状及睡眠障碍,每一条目均按照严重程度由无到极重计0～4分,评分越高表明症状越严重[7]。
3.1.2 肠道菌群检测 ①粪便样本采集:于治疗前1 d和治疗后两个月采集受试者新鲜粪便样本,用无菌勺挖取新鲜粪便的中部内侧,放入无菌保存管,即刻密封、编号,并在2 h之内放入-80 ℃环境中保存,最终将样本送至上海美吉生物医药科技有限公司检测。②高通量16SrDNA测序:按照E.Z.N.A.Soil DNA Kit试剂盒说明提取粪便样本中微生物总DNA,利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA;根据16SrDNA可变V3-V4区,合成带有barcode的特异引物进行PCR扩增;每个样本3个重复。将同一样本的PCR产物混合后使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen bios-ciences,Union City,CA,USA)进行回收产物纯化,2%琼脂糖凝胶电泳检测,并用QuantusTMFluorometer(Promega,USA)对回收产物进行检测定量,建立最终的文库;利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序。③生物信息学分析:使用UPARSE软件,根据97%的相似度对序列进行OTU聚类,按照界、门、纲、目、科、属及种统计各样本的群落物种组成,使用R语言软件(Version3.3.1)绘制韦恩图和群落柱形图;运用mothur进行Alpha多样性指数分析(ace、chao、sobs、shannon及simpson指数),得到群落中物种的丰富度和多样性等信息;应用主坐标分析(Principal co-ordinates analysis,PCoA)研究对照组和穴位埋线组治疗前后样本群落组成的相似性或差异性,使用R软件绘制PCoA图;为了评估两组样本在门和属水平物种丰度差异的显著性,进行组间差异显著性检验;使用LEfSe软件进行LEfSe(LDA efect size)分析,探究对照组和穴位埋线组治疗前后差异有统计学意义的菌群在各分类水平上的物种分类单元,根据LDA评分=2筛选各组优势菌群。
3.2 统计学处理
3.3 结果
3.3.1 两组治疗前后海洛因稽延性戒断症状自评量表评分比较 海洛因稽延性戒断症状自评量表每一条目均按照严重程度由无到极重计0～4分,0分为无,1分为轻,2分为中,3分为重,4分为极重,共19个条目。与治疗前比较,两组治疗后4个因子评分均降低,差异具有统计学意义(P<0.01);治疗后与对照组比较,穴位埋线组4个因子评分均下降,差异具有统计学意义(P<0.01)。见表2。
表2 两组治疗前后海洛因稽延性戒断症状自评量表评分比较
3.3.2 两组肠道菌群OTU物种组成分析 治疗前对照组与穴位埋线组OTU数目分别为222和227,治疗2个月后对照组OTU数目稍有减少,为206,而穴位埋线组OTU数目显著增多,为288。见图1。
注:BCG.治疗前对照组;ACG.治疗后对照组;BTG.治疗前穴位埋线组;ATG.治疗后穴位埋线组。图1 两组治疗前后肠道菌群OTU韦恩图
3.3.3 两组肠道菌群Alpha多样性差异分析 箱形图直观地显示了两组治疗前后组间与组内肠道菌群的差异,见图2。结果显示,与治疗前比较,两组治疗后chao、sobs指数降低(P<0.05);治疗后与对照组比较,穴位埋线组simpson指数增加,ace、shannon指数降低,差异比较无统计学意义(P>0.05)。
注:BCG.治疗前对照组;ACG.治疗后对照组;BTG.治疗前穴位埋线组;ATG.治疗后穴位埋线组。图2 两组治疗前后肠道菌群Alpha多样性分析
3.3.4 两组肠道菌群Beta多样性差异分析 运用主坐标分析(Principal co-ordinates analysis,PCoA)和非度量多维尺度分析(Non-metric multidimensional scaling,NMDS)评估两组微生物群落之间的差异。结果显示,治疗前两组肠道群落结构相似,而治疗后穴位埋线组偏离对照组,表明治疗后两组肠道菌群结构差异有统计学意义(P<0.01)。见图3。
注:BCG.治疗前对照组;ACG.治疗后对照组;BTG.治疗前穴位埋线组;ATG.治疗后穴位埋线组。图3 两组治疗前后肠道菌群Beta多样性分析
3.3.5 门水平物种组成和差异分析 两组治疗前后肠道菌群优势菌门排名前3为厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteriota)和拟杆菌门(Bacteroi-dota)。与治疗前比较,两组厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteriota)相对丰度均下降(P<0.05),拟杆菌门(Bacteroidota)相对丰度增加(P<0.05)。与治疗后对照组比较,穴位埋线组放线菌门(Actinobacteriota,P<0.05)和变形菌门(Proteobacteria,P<0.01)相对丰度增加。见图4。
注:BCG.治疗前对照组;ACG.治疗后对照组;BTG.治疗前穴位埋线组;ATG.治疗后穴位埋线组。图4 两组治疗前后肠道菌群门水平物种组成和差异分析
3.3.6 属水平物种组成和差异分析 两组治疗前后肠道菌群优势菌属排名前3为双歧杆菌属(Bifidobacterium)、布劳特氏属(Blautia)和粪杆菌属(Faecalibacterium)。与治疗前比较,治疗后穴位埋线组主要是瘤胃球菌(Ruminococcus)、粪杆菌属(Faecalibacterium)和拟杆菌属(Bacteroides)相对丰度增加(P<0.05);治疗后与对照组比较,穴位埋线组双歧杆菌属(Bifidobacterium)相对丰度增加。见图5。
注:BCG.治疗前对照组;ACG.治疗后对照组;BTG.治疗前穴位埋线组;ATG.治疗后穴位埋线组。图5 两组治疗前后肠道菌群属水平物种组成和差异分析
3.3.7 两组差异物种LEfSe分析 LEfSe分析进化分支图不同颜色节点表示在对应组别中显著富集,且对组间差异存在显著影响的微生物类群;淡黄色节点表示在不同分组中差异无统计学意义(P>0.05),对照组治疗前相对丰度较大的菌群是梭菌目(Clostridiales)、韦荣氏菌科(Veillonellaceae)和梭菌科(Clostri-diaceae)。对照组治疗后相对丰度较大的菌群是粪杆菌属(Faecalibacterium)、Clostridium_sensu_stricto_1。穴位埋线组治疗前相对丰度较大的菌群是丹毒丝菌目(Erysipelotrichales)、放线菌目(Actinomycetales)。穴位埋线组治疗后相对丰度较大的菌群是Bacilli、乳杆菌科(Lactobacilaceae)和乳杆菌属(Lactobacillus)。见图6。
注:BCG.治疗前对照组;ACG.治疗后对照组;BTG.治疗前穴位埋线组;ATG.治疗后穴位埋线组。图6 两组治疗前后肠道菌群差异物种LEfSe分析
越来越多的研究证明[8-9],肠道菌群与毒品成瘾之间有一定关系,阿片类药物的使用会导致肠道微生物的紊乱。从中医角度来看,脑与肠在生理、病理和经络循行上相互关联、相互影响[10]。海洛因依赖者在急性戒断期后,会出现与脑肠相关的焦虑、抑郁、失眠、便秘及疼痛等稽延性戒断症状。中医将稽延性戒断症状称作“断瘾后诸症”,主要病因病机为“烟毒内蕴”。李群堂等[11]认为睡眠障碍是脱毒员最常见的中医证候,治疗可以将“心神不宁”作为脱毒后中医康复治疗与干预的切入点。杨绍春等[12]调查发现:出现频次最高的前3个证候是肝郁气滞、心脾两虚和心血不足。因此,本研究从养心安神、调和气血、补肾助阳与健脾和胃的治则治疗海洛因依赖者稽延性戒断症状,从而降低复吸的可能。
本研究治疗的穴位处方主要选取百会、曲池、心俞、天枢、关元、足三里及三阴交。百会为督脉穴位,可安神定志,对海洛因依赖者失眠、焦虑等精神类症状有所改善;曲池为手阳明大肠经之合穴,具有调理肠胃的作用;心俞为足太阳膀胱经穴,具有养心安神、宁心定惊等功效;天枢属足阳明胃经,为大肠募穴,能够补益气血,改善各种消化道疾病;关元有补肾助阳、补益下焦之功,可提高人体免疫力以及具有抗癌作用;足三里为足阳明胃经合穴,具有健脾和胃、镇静止痛的功用;三阴交为足三阴经交会穴,可健脾化湿、调节情志。诸穴合用,可以改善精神障碍症状,缓解海洛因依赖者肌肉关节疼痛及胃肠道反应等戒断症状并且能改善肝肾功能。
本研究结果显示,由海洛因稽延性戒断症状自评量表评分可见,穴位埋线组评分低于对照组,说明从主观上讲,穴位埋线疗法对于缓解稽延性戒断症状疗效较好。治疗后穴位埋线组OTU数目和simpson指数高于治疗前穴位埋线组和治疗后对照组,提示海洛因依赖者肠道菌群多样性增高,且瘤胃球菌属和有益菌双歧杆菌属相对丰度增加。LEfSe显示,乳杆菌科和乳杆菌属是治疗后穴位埋线组相对丰度较高的菌群。这些增高的菌群改善了海洛因依赖者肠道菌群的失调,调节了神经递质,对神经精神障碍发挥了作用。提示穴位埋线疗法可能通过改善肠道菌群起到减轻稽延性戒断症状降低毒瘾的作用。
肠道菌群代谢物在宿主生物学和病理学中的作用的评估越来越多,如作用于免疫系统、脂肪组织、中枢神经系统和神经内分泌系统[13-15]。瘤胃球菌属于厚壁菌门[16],Nakamura YK等[17]认为厚壁菌门可以提供相对较高水平的短链脂肪酸。短链脂肪酸作为肠道微生物代谢的最终产物,能够进入循环系统,向大脑传递信号,对中枢神经系统功能产生广泛影响[18],能有效地提高机体免疫力、增强肠道功能与预防疾病,如阿尔茨海默病、帕金森病、焦虑、抑郁与胃肠疾病等[19-21]。本研究中,治疗后穴位埋线组瘤胃球菌属的相对丰度高于治疗前穴位埋线组和治疗后对照组,说明穴位埋线可能有助于缓解稽延期海洛因依赖者的焦虑、抑郁等戒断症状。
有益菌双歧杆菌属和乳杆菌能平衡肠道菌群、改善便秘和改善海洛因戒断症状相关的行为,如焦虑、抑郁[22-23]。李亦汉等[24]认为两歧双歧杆菌(双歧杆菌属的一种)能提升便秘小鼠肠道中乙酸的含量,上调小鼠白细胞介素10及调节性T细胞含量,减轻肠道炎症,提高粪便含水量进而缓解便秘。罗国帅等[25]认为双歧杆菌可提高大鼠前额叶、杏仁核、海马与纹状体等脑区单胺类神经递质 5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)及多巴胺的浓度从而起到抗抑郁作用,而药物成瘾正好涉及这些神经递质[26]。近年来,研究人员提出了“益心菌”(psychobiotics)的概念,即对神经功能有积极影响的益生菌,比如双歧杆菌、乳杆菌等。这些益心菌不仅在宿主肠道中繁殖,还通过双向肠-脑轴进行交流,其作用被广泛扩散到大脑。因此,很多证据证明了益心菌在精神疾病和脑部疾病方面的有效性[27]。本研究中,治疗后穴位埋线组双歧杆菌属的相对丰度高于治疗前穴位埋线组和治疗后对照组,且治疗后穴位埋线组乳杆菌在LEfSe 分析中相对丰度占比很大,表明通过穴位埋线使海洛因依赖者肠道菌群中双歧杆菌属和乳杆菌增加,改善了便秘、抑郁与焦虑等海洛因戒断症状。
本研究发现了穴位埋线疗法能够通过穴位刺激增加有益菌,改善肠道功能从而缓解神经系统异常出现的症状,最终达到减轻海洛因戒断症状的效果。研究不足之处:本研究样本量较少,还不能做到穴位埋线对稽延期海洛因戒断症状干预作用的深入探索;海洛因依赖者肠道菌群的文献较少,参考文献的搜索也有限,有些只能以抑郁或精神障碍作为搜索词,因此海洛因依赖者肠道菌群的结构分析,还需进一步研究,但本研究结果能初步表明穴位埋线可以调节肠道菌群结构,提高机体免疫力。未来需进一步扩大样本量,并进行健康组观察,以期为毒瘾医学的发展作出贡献。
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