郑煦阳 ，李凌宇，胡玥，尚海*，邹忠梅 *
1.天津中医药大学 研究生院，天津 301600
2.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193
天然产物是发现新型生物活性分子的重要源泉[1]。其中含有5-(3-吲哚基)唑结构的天然产物表现出多种生物活性，如抗病毒[2]、抗菌[3]、抗癌[4]、抗氧化[5]、抑制细胞增殖[6]和杀虫活性[7]。从丁香假单胞杆菌的发酵产物中分离出来的labradorin 1 就是一种含有5-(3-吲哚基)唑母核结构的天然产物，其对人肿瘤细胞系MCF-7、KM20L2 表现出明显的抗增殖活性，GI50值分别为3.9、3.5 µg/mL[8]。1,3,4-二唑是一种含有1 个氧原子和2 个氮原子的五元芳香杂环化合物，具有广泛的生物活性，包括抗癌[9]、抗微生物[10]、抗真菌[11]、抗炎[12]和抗艾滋病[13]。值得注意的是，由于其独特的结构，常常作为重要的药效团出现在抗肿瘤药物设计中。本研究以labradorin 1 为研究对象，采用骨架跃迁策略，将labradorin 1 中的唑环替换为1,3,4-二唑环，设计并合成了15 个吲哚-1,3,4-二唑类化合物，其结构均经1H-NMR、13C-NMR 和HR-ESI-MS 进行确证。通过MTT 法测试了目标化合物对HeLa、SCG-7901 和MDA-MB-231 3 种肿瘤细胞的体外抗增殖活性，并筛选出活性较好的化合物，进行了作用机制研究。
Bruker AV III 600 核磁共振仪（北京布鲁克科技有限公司）；
Waters SYNAPT G2 HDMS 高分辨质谱仪（上海沃特世科技有限公司）；
Mettler-AB104-S 分析天平（梅特勒托利多测量设备有限公司）；
IKARCT basic 磁力搅拌器（德国艾卡仪器设备有限公司）；
EYELA-N1100 旋转蒸发仪（东京理化器械株式会社）；
DLSB-5/20 型低温冷却循环泵（郑州长城科工贸有限公司）；
H1 型多功能酶标仪（美国Biotek 公司）；
FACS Calibur 流式细胞仪（美国BD公司）；
多功能成像分析系统（上海勤翔科学仪器有限公司）；
PSC603-07S 型荧光显微镜（美国OPLENIC 公司）；
薄层色谱板GF254（烟台化工厂）；
快速柱色谱用硅胶（200～300 目，青岛海洋化工厂）。
吲哚-3-甲酰肼（毕得科技有限公司），3,3,3-三氟丙酸乙酯、苯胺、异丙胺、苄胺、对氟苄胺、邻氟苄胺、间氟苄胺、对甲基苯胺、对甲基苄胺、对溴苄胺、对氟苯胺、对氯苯胺、苯乙胺、3-氨甲基吡啶、2-呋喃甲胺、对溴苯胺均购自北京伊诺凯科技有限公司；
HATU（韶远科技有限公司），DIEA（安耐吉化学），碳酸钠、氢氧化钠（北京通广精细化工有限公司）；
其余试剂均为分析纯，购于天津北联精细化学品开发公司。
人宫颈癌细胞HeLa、人胃癌细胞SCG-7901、人乳腺癌细胞MDA-MB-231 和人胚肺成纤维细胞CCC-HPF-1 均购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，二甲亚砜（DMSO，上海阿拉丁试剂有限公司）；
噻唑蓝（MTT，碧云天生物技术有限公司）、胎牛血清（货号10099-141）、DMEM 高糖培养基（货号8122175）、青霉素-链霉素（货号15140-122）购自Gibco 公司；
2",7"-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA，HY-D0940-5 mg，MedChemExpress 公司）；
含DAPI 抗荧光淬灭封片液（P0131-5 mL）购自碧云天生物技术有限公司；
Annexin V-APC/PI 细胞凋亡试剂盒（AP107-100T）购自联科生物技术有限公司。
2.1 化合物的合成
以吲哚-3-甲酰肼为起始原料，通过［4+1］环加成反应、水解反应和缩合反应得到目标化合物，合成路线见图1。
图1 化合物6a～6o 的合成路线Fig.1 Synthetic route of compounds 6a — 6o
2.1.1 化合物3的合成 将吲哚-3-甲酰肼（100 mg，0.57 mmol）、3,3,3-三氟丙酸乙酯（82.5 µL，0.63 mmol）、Na2CO3（90.6 mg，0.85 mmol）和无水乙醇（3 mL）依次加入一个干燥的密封管中。将混合物加热至90 ℃反应7 h，TLC 监测反应完全。将反应液冷却至室温，硅藻土滤过，并用醋酸乙酯洗涤，浓缩滤液，残余物经硅胶柱色谱纯化，得到化合物3（160 mg，产率88%）。1H-NMR（600 MHz，DMSOd6）δ：12.03（s，1H)，8.16（d，J＝2.9 Hz，1H），8.08（d，J＝7.5 Hz，1H，7.53（d，J＝7.8 Hz，1H），7.26（ddd，J＝7.5、6.7、1.2 Hz，1H），7.23（ddd，J＝8.0、7.0、1.2 Hz，1H），4.25（s，2H），4.17（q，J＝7.2 Hz，2H），1.22（t，J＝7.1 Hz，3H）。
2.1.2 化合物4 的合成 将化合物3（0.59 mmol）溶于四氢呋喃（2 mL）中，加入10% NaOH 水溶液1 mL，室温搅拌0.5 h，TLC 监测反应完全。反应液浓缩至1 mL，加入稀盐酸调pH 值至2 左右，析出白色固体，抽滤，收集滤饼，得化合物4（83 mg，产率58%）。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：13.15（s，1H），12.08（s，1H），8.16（d，J＝2.9 Hz，1H），8.08（d，J＝7.6 Hz，1H），7.53（d，J＝7.9 Hz，1H），7.28～7.21（m，2H），4.12（s，2H）。
2.1.3 化合物6a～6o 的合成 将化合物4（0.29 mmol）和胺类化合物5（0.37 mmol）溶于DMF（2 mL）中，依次加入HATU（0.37 mmol）和DIEA（0.37 mmol），室温搅拌2 h，TLC 监测反应完全。将反应液倒入水中，用醋酸乙酯（20 mL×3）萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，滤过，减压浓缩至析出大量固体，抽滤，滤饼依次用石油醚、二氯甲烷洗涤，收集滤饼，干燥，得到化合物6a～6o。
2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-苯乙酰胺（6a）：白色固体，收率45.6%。mp 252.0～253.2 ℃；
1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ12.01（s，1H），10.47（s，1H），8.16（d，J＝2.7 Hz，1H），8.09（d，J＝7.8 Hz，1H），7.60（d，J＝7.5 Hz，2H），7.52（d，J＝8.0 Hz，1H），7.34（t，J＝7.5 Hz，2H），7.26（ddd，J＝7.5、6.6、1.3 Hz，1H），7.23（ddd，J＝8.6、7.0、1.3 Hz，1H），7.09（t，J＝ 7.4 Hz，1H），4.18（s，2H）；
13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ164.5，162.3，159.6，138.7，136.4，128.9（2C），128.1，124.1，123.7，122.9，121.2，120.2，119.2（2C），112.5，99.4，33.6；
HR-MSm/z：319.119 5 [M＋H]+。
2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(对甲苯基)乙酰胺（6b）：白色固体，收率54.6%。mp 249.1～251.6 ℃；
1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.00（d，J＝1.8 Hz，1H），10.37（s，1H），8.15（d，J＝2.8 Hz，1H），8.09（d，J＝7.5 Hz，1H），7.53（d，J＝8.0 Hz，1H），7.49（d，J＝8.5 Hz，2H），7.26（ddd，J＝7.4、6.5、1.3 Hz，1H），7.23（ddd，J＝8.5、7.4、1.3 Hz，1H），7.14（d，J＝8.3 Hz，2H），4.16（s，2H），2.26（s，3H）；
13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ164.2，162.3，159.7，136.4，136.2，132.7，129.3（2C），128.1，124.1，122.8，121.2，120.2，119.2（2C），112.4，99.4，33.5，20.5；
HR-MSm/z：333.135 2 [M＋H]+。
2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-氟苯基)乙酰胺（6c）：白色固体，收率63.5%。mp 262.7～264.8 ℃；
1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ12.01（d，J＝1.7 Hz，1H），10.53（s，1H），8.16（d，J＝2.9 Hz，1H），8.09（d，J＝7.8 Hz，1H），7.64～7.61（m，2H），7.53（d，J＝8.0 Hz，1H），7.27（ddd，J＝7.5、6.6、1.3 Hz，1H），7.22（ddd，J＝8.3、7.0、1.2 Hz，1H），7.20～7.16（m，2H），4.17（s，2H）；
13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：164.4，162.4，159.6，158.2（d，J＝240.5 Hz），136.4，135.1（d，J＝2.0.Hz），128.1，124.1，122.9，121.2，121.0（d，J＝7.8 Hz），120.2，115.5（d，J＝21.6 Hz），112.5，99.4，33.5；
HR-MSm/z：337.110 1 [M＋H]+。
2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-氯苯基)乙酰胺（6d）：白色固体，收率49.0%。mp 254.5～256.0 ℃；
1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.02（d，J＝2.1 Hz，1H），10.61（s，1H），8.16（d，J＝2.9 Hz，1H），8.10（d，J＝7.5 Hz，1H），7.65～7.63（m，2H），7.53（d，J＝7.9 Hz，1H），7.40～7.38（m，2H），7.27（ddd，J＝7.7、6.6、1.2 Hz，1H），7.23（ddd，J＝8.2、7.8、1.2 Hz，1H），4.20（s，2H）；
13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ164.8，162.5，159.6，137.8，136.6，128.9（2C），128.2，127.4，124.2，123.0，121.3，120.9（2C），120.3，112.6，99.5，33.8；
HR-MSm/z：353.080 5[M＋H]+。
2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-溴苯基)乙酰胺（6e）：白色固体，收率34.8%。mp 256.3～258.0 ℃；
1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.02（d，J＝1.8 Hz，1H），10.61（s，1H），8.12（d，J＝2.3 Hz，1H），8.08（d，J＝7.5 Hz，1H），7.59（d，J＝7.5 Hz，2H），7.54～7.52（m，3H），7.27（ddd，J＝7.6、6.5、1.2 Hz，1H），7.23（ddd，J＝8.2、7.0、1.2 Hz，1H），4.20（s，2H）；
13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ164.9，162.4，159.5，138.1，136.4，131.7（2C），128.1，124.1，122.9，121.2（2C），121.1，120.2，115.3，112.5，99.4，33.7；
HR-MSm/z：397.030 0 [M＋H]+。
2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-苄基乙酰胺（6f）：白色固体，收率 64.5%。mp 237.2～239.2 ℃；
1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.00（s，1H），8.87（t，J＝5.9 Hz，1H），8.12（d，J＝2.9 Hz，1H），8.08（d，J＝7.9 Hz，1H），7.53（d，J＝7.7 Hz，1H），7.35～7.30（m，4H），7.28～7.23（m，3H），4.34（d，J＝5.9 Hz，2H），4.00（s，2H）；
13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ165.6，162.2，159.9，139.0，136.4，128.4（2C），128.0，127.3（2C），127.0，124.1，122.9，121.2，120.2，112.5，99.5，42.5，32.6；
HR-MSm/z：333.135 2 [M＋H]+。
2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-甲基苄基)乙酰胺（6g）：白色固体，收率55.2%。mp 243.0～245.6 ℃；
1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.00（d，J＝1.5 Hz，1H），8.81（t，J＝5.9 Hz，1H），8.12（d，J＝2.9 Hz，1H），8.07（d，J＝7.8 Hz，1H），7.53（d，J＝8.3 Hz，1H），7.27（ddd，J＝7.6、6.6、1.3 Hz，1H），7.22（ddd，J＝8.2、7.0、1.1 Hz，1H），7.19（d，J＝7.9 Hz，2H），7.14（d，J＝7.9 Hz，2H），4.29（d，J＝5.9 Hz，2H），3.97（s，2H），2.28（s，3H）；
13C-NMR（150 MHz，DMSOd6）δ165.5，162.2，159.9，136.4，136.0，135.9，128.9（2C），128.0，127.4（2C），124.1，122.9，121.2，120.2，112.5，99.5，42.2，32.6，20.7；
HR-MSm/z：347.150 8 [M＋H]+。
2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-硝基苄基)乙酰胺（6h）：白色固体，收率40.4%。mp 195.2～197.9 ℃；
1H-NMR（600 MHz，DMSOd6）δ：12.00（d，J＝1.5 Hz，1H），9.03（t，J＝6.3 Hz，1H），8.21（d，J＝8.8 Hz，2H），8.14（d，J＝2.7 Hz，1H），8.07（d，J＝7.9 Hz，1H），7.58（d，J＝9.0 Hz，2H），7.53（d，J＝7.9 Hz，1H),7.27（ddd，J＝8.3、7.5、1.1 Hz，1H），7.22（ddd，J＝8.0、6.9、1.0 Hz，1H），4.48（d，J＝6.1 Hz，2H），4.04（s，2H）；
13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ166.0，162.3，159.8，147.2，146.5，136.4，128.3（2C），128.0，124.1，123.6（2C），122.9，121.2，120.2，112.5，99.6，42.0，32.5；
HR-MSm/z：378.120 2 [M＋H]+。
2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(2-氟苄基)乙酰胺（6i）：白色固体，收率48.2%。mp 237.2～239.5 ℃；
1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.00（d，J＝1.3 Hz，1H），8.88（t，J＝5.9 Hz，1H），8.12（d，J＝2.9 Hz，1H），8.07（d，J＝7.7 Hz，1H），7.53（d，J＝8.0 Hz，1H），7.42～7.39（m，1H），7.35～7.32（m，1H），7.26（ddd，J＝7.5、6.7、1.3 Hz，1H），7.24～7.17（m，3H），4.37（d，J＝5.8 Hz，2H），4.00（s，2H）；
13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ165.7，162.2，160.13（d，J＝244.4 Hz），159.8，136.4，129.7（d，J＝4.4 Hz），129.1（d，J＝8.4 Hz），128.0，125.5（d，J＝15.0 Hz），124.4（d，J＝3.5 Hz），124.1，122.9，121.2，120.2，115.2（d，J＝21.1 Hz），112.5，99.5，36.4（d，J＝4.4 Hz），32.5；
HR-MSm/z：351.125 7 [M＋H]+。
2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(3-氟苄基)乙酰胺（6j）：白色固体，收率48.3%。mp 239.2～241.5 ℃；
1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.00（s，1H），8.91（t，J＝6.0 Hz，1H），8.12（d，J＝2.8 Hz，1H），8.07（d，J＝7.7 Hz，1H），7.53（d，J＝7.9 Hz，1H），7.40～7.36（m，1H），7.26（ddd，J＝7.5、6.6、1.2 Hz，1H），7.23（ddd，J＝8.4、7.1、1.1 Hz，1H），7.17～7.13（m，2H），7.11～7.07（m，1H），4.36（d，J＝6.0 Hz，2H），4.02（s，2H）；
13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：165.7，162.2，160.1（d，J＝244.4 Hz），159.8，136.4，129.7（d，J＝4.4 Hz），129.1（d，J＝8.4 Hz），128.0，125.5（d，J＝15.0 Hz），124.4（d，J＝3.5 Hz），124.1，122.9，121.2，120.2，115.2（d，J＝21.1 Hz），112.5，99.5，36.4（d，J＝4.4 Hz），32.5；
HR-MSm/z：351.125 7 [M＋H]+。
2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-氟苄基)乙酰胺（6k）：白色固体，收率51.5%。mp 229.6～231.0 ℃；
1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.00（d，J＝1.8 Hz，1H），8.88（t，J＝5.9 Hz，1H），8.12（d，J＝2.7 Hz，1H），8.07（d，J＝7.7 Hz，1H），7.53（d，J＝8.2 Hz，1H），7.37～7.33（m，2H），7.27（ddd，J＝7.4、6.8、1.3 Hz，1H），7.22（ddd，J＝8.4、7.3、1.2 Hz，1H），7.19～7.15（m，2H），4.32（d，J＝5.8 Hz，2H），3.32（s，2H）；
13CNMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：165.6，162.2，161.3（d，J＝242.0 Hz），159.9，136.4，135.2（d，J＝3.2 Hz），129.3（d，J＝8.0 Hz），128.0，124.1，122.9，121.2，120.2，115.1（d，J＝21.0 Hz），112.5，99.5，41.8，32.5；
HR-MSm/z：351.125 7 [M＋H]+。
2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-溴苄基)乙酰胺（6l）：白色固体，收率33.6%。mp 210.2～212.2 ℃；
1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.00（s，1H），8.90（t，J＝6.2 Hz，1H），8.13（s，1H），8.07（d，J＝7.3 Hz，1H），7.52～7.54（m，3H），7.28～7.21（m，4H），4.31（d，J＝6.2 Hz，2H），4.00（s，2H）；
13C-NMR（150 MHz，DMSOd6）δ：165.7，162.3，159.8，138.5，136.4，131.2（2C），129.6（2C），128.0，124.1，122.9，121.2，120.2，120.0，112.5，99.4，41.8，32.5；
HR-MSm/z：411.045 7 [M＋H]+。
2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-硝基苄基)乙酰胺（6m）：白色固体，收率72.9%。mp 193.4～194.8 ℃；
1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.01（d，J＝1.9 Hz，1H），8.93（t，J＝5.8 Hz，1H），8.54（d，J＝1.5 Hz，1H），8.48（d，J＝8.5 Hz，1H），8.12（d，J＝9.0 Hz，1H），8.07（d，J＝7.8 Hz，1H），7.72（d，J＝7.8 Hz，1H），7.53（d，J＝7.8 Hz，1H），7.37（dd，J＝4.7、3.0 Hz，1H），7.27（ddd，J＝7.5、6.8、1.3 Hz，1H），7.23（ddd，J＝8.3、7.5、1.2 Hz，1H），4.37（d，J＝5.8 Hz，2H），4.00（s，2H）；
13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：165.8，162.3，159.8，148.8，148.3，136.4，135.2，134.5，128.0，124.1，123.5，122.9，121.2，120.2，112.5，99.4，40.2，32.5；
HR-MSm/z：334.130 4 [M＋H]+。
2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(呋喃-2-基甲基)乙酰胺（6n）：白色固体，收率39.6%。mp 208.5～210.5 ℃；
1H-NMR（600 MHz，DMSOd6）δ：12.02（d，J＝1.9 Hz，1H），8.84（t，J＝5.5 Hz，1H），8.13（d，J＝2.8 Hz，1H），8.08（d，J＝7.7 Hz，1H），7.61（dd，J＝1.9 Hz，J＝0.8 Hz，1H），7.53（d，J＝8.0，1H），7.27（ddd，J＝7.7、6.7、1.3 Hz，1H），7.23（ddd，J＝8.5、7.3、1.2 Hz，1H），6.42（dd，J＝3.8、1.8 Hz，1H），6.31（dd，J＝3.2、0.6 Hz，1H），4.33（d，J＝5.6 Hz，2H），3.96（s，2H）；
13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：165.6，162.4，159.5，151.8，142.5，136.5，128.1，124.2，123.0，121.3，120.3，112.6，110.6，107.3，99.6，35.9，32.5；
HR-MSm/z：323.114 4 [M＋H]+。
2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-异丙基乙酰胺（6o）：白色固体，收率67%。mp 242.0～243.6 ℃；
1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.00（s，1H），8.26（d，J＝7.7 Hz，1H），8.12（d，J＝ 2.3 Hz，1H），8.08（d，J＝7.5 Hz，1H），7.53（d，J＝7.5 Hz，1H），7.26（ddd，J＝7.5、6.6、1.3 Hz，1H），7.23（ddd，J＝8.4、7.3、1.2 Hz，1H），3.88～3.83（m，3H），1.10（d，J＝6.6 Hz，6H）；
13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：164.4，163.2，160.0，136.4，127.9，124.1，122.8，121.1，120.2，112.5，99.5，55.0，40.9，32.6，22.3（2C）；
HR-MSm/z：285.135 2[M＋H]+。
2.2 化合物的抗肿瘤活性研究
2.2.1 目标化合物对肿瘤细胞增殖的影响 采用MTT 法测试目标化合物6a～6o 对HeLa、SCG-7901和MDA-MB-231 细胞的体外抗肿瘤活性。将HeLa、SCG-7901、MDA-MB-231 细胞以5×104个/mL 密度接种到96 孔板中，每孔100 μL。在CO2培养箱中培养24 h。设置对照组和给药组，给药组每孔加入梯度稀释的化合物6a～6o 药液（终浓度分别为2.5、5、10、20、40 μmol/L）200 μL，对照组加入含有等体积DMSO 的培养基。培养48 h 后，加入5 mg/mL MTT 溶液5 μL，再继续培养4 h，弃去上清液，每孔加入DMSO 100 μL，震荡10 min，酶标仪测定490 nm 波长处的吸光度（A）值。实验设置3 个平行孔，重复2 次，取平均值。采用GraphPad Prism 9 计算目标化合物6a～6o 对肿瘤细胞的半数抑制浓度（IC50），结果见表1。
表1 化合物6a～6o 的体外抗肿瘤活性Table 1 In vitro antitumor effect of compounds 6a — 6o
化合物6f、6g、6k、6l 表现出抗肿瘤活性，其中化合物6f、6g 对3 种肿瘤细胞均表现出良好的抗增殖作用。活性最好的化合物6f 对HeLa、SCG-7901和MDA-MB-231 细胞的IC50分别为（4.35±0.32）、（3.94±0.03）、（4.04±1.06）μmol/L。初步的构效关系研究表明，苄胺衍生物具有良好的抗肿瘤活性。其中苄胺的苯环上无取代基或为甲基取代基时，衍生物表现出明显的抗肿瘤活性。当苯环上的取代基替换为卤素或硝基取代时则活性下降，甚至消失，说明苄胺的苯环上连有供电子基团有助于抗肿瘤活性。当酰胺的氨基部分由苄胺替换为苯胺、烷基胺时，衍生物的抗肿瘤活性丧失。此外，将苄胺的苯基替换为吡啶或呋喃基团时，衍生物同样无明显抗肿瘤作用。说明苄胺基团对衍生物发挥抗肿瘤活性至关重要。
为了进一步考察目标化合物抗肿瘤作用是否具有选择性，实验测试了化合物6f、6g 对人胚肺成纤维细胞CCC-HPF-1 存活率的影响，结果见表1。结果显示，化合物6f、6g 的选择性指标[SI，SI＝IC50(CCC-HPF-1)/IC50(SGC-7901)]分别为 3.54、11.09，具有良好的细胞选择性。考虑到化合物6f 的活性更优，故选择化合物6f 进行后续实验。
2.2.2 化合物6f 抑制SCG-7901 细胞增殖 采用克隆形成实验考察化合物6f 对SCG-7901 细胞增殖的影响。实验设置空白组和给药组。取对数生长期的SCG-7901 细胞，调整细胞密度至800 个/mL，接种于6 孔板内，待细胞贴壁后，给药组分别加入不同浓度的化合物6f，终浓度分别为10、20、40 μmol/L，空白组加入含等体积DMSO 的培养基。培养14 d后，弃去上清液，加入4%多聚甲醛固定细胞10 min，除去4%多聚甲醛。使用结晶紫染色液染色10 min，水洗除去多余的结晶紫染色液，晾干后进行拍照记录。用Image J 软件分析细胞集落数量（大于50 个细胞的细胞群为1 个集落），结果见图3。在40 μmol/L 的浓度下，化合物6f 可显著抑制细胞集落的形成，SCG-7901 细胞的平均集落数量由711 个（空白组）减少至2 个。
图3 化合物6f 对SCG-7901 细胞增殖的影响（,n＝3）Fig.3 Effect of compound 6f on colony formation of SCG-7901 cells ,n＝3)
2.2.3 化合物6f 诱导SCG-7901 细胞凋亡和坏死 采用Annexin V-APC/PI 双染法检测化合物6f 对SCG-7901 细胞凋亡和坏死的影响[14]。实验设置空白组和给药组。取对数生长期的SCG-7901 细胞，调整细胞密度至3×105个/mL，接种于6 孔板中，每孔1 mL。待细胞贴壁后，给药组分别加入不同浓度的化合物6f，终浓度分别为10、20、40 μmol/L，空白组加入含等体积DMSO 的培养基。培养24 h 后，收集细胞，PBS 洗涤细胞，将细胞转移至流式管中，向流式管内分别加入Annexin V-APC（10 μL）和PI（5 μL）染液，室温孵育10 min，使用流式细胞仪检测凋亡和坏死细胞的比例。并使用Flow Jo 软件进行数据分析，数据显示为伪彩图，结果见图4。40 μmol/L 化合物6f 处理24 h 后，SCG-7901 细胞的早期凋亡细胞占比由4.76%升高到17.6%，晚期凋亡细胞占比由1.92%上升到13.2%。细胞凋亡率（早期凋亡与晚期凋亡）随浓度的升高而升高，呈一定的浓度相关性。提示化合物6f 通过促进肿瘤细胞的凋亡从而发挥抗肿瘤作用。
图4 化合物6f 对SCG-7901 细胞凋亡的影响（,n＝3）Fig.4 Effect of compound 6f on apoptosis rate of SCG-7901 cells ,n＝3)
2.2.4 化合物6f 对SCG-7901 细胞形态学的影响 采用DAPI 染色法检测化合物6f 对SCG-7901 细胞凋亡核染色质形态学的影响。实验设置空白组和给药组。取对数生长期SCG-7901 细胞，以4×104个/mL的细胞密度接种于置有直径为8 mm 爬片的48 孔板内，待细胞贴壁后，给药组分别加入不同浓度的化合物6f，终浓度分别为5、10、20 μmol/L，空白组加入含等体积DMSO 的培养基。培养24 h，弃去上清，PBS 洗涤细胞，4%多聚甲醛固定细胞10 min，PBS 洗涤细胞3 次，取出爬片，置于含有DAPI 抗荧光淬灭封片液的载玻片上，4 ℃孵育15 min，使用荧光显微镜观察染色情况并拍照记录，结果见图5。空白组的细胞核形态规则，且呈弥散均匀的淡蓝色荧光。给予不同浓度的化合物6f 后，SCG-7901细胞的细胞核固缩，染色质高度凝聚，说明化合物6f 能够诱导SCG-7901 细胞的凋亡。
图5 化合物6f 对SCG-7901 细胞核形态变化的影响Fig.5 Effect of compound 6f on the nuclear morphological changes of SCG-7901 cells
2.2.5 化合物6f 诱导SCG-7901 细胞活性氧（ROS）水平升高 采用DCFH-DA 染色法检测化合物6f 对SCG-7901 细胞中ROS 含量的影响。实验设置空白组和给药组。取对数生长期的SCG-7901 细胞，以3×105个/mL 的细胞密度接种于24 孔板内。待细胞贴壁后，给药组分别加入不同浓度的化合物6f，终浓度分别为5、10、20 μmol/L，空白组加入含等体积DMSO 的培养基。培养24 h，弃去上清液，加入DCFH-DA 荧光探针（10 μmol/L），室温避光孵育30 min，无血清培养基洗涤细胞3 次，使用荧光显微镜观察染色情况并拍照记录，结果见图6。与空白组相比，化合物6f 处理后的细胞内DCFH-DA的平均荧光强度明显增强，说明细胞内的ROS 水平显著升高，且具有剂量相关性。结果表明，化合物6f 可有效促进SCG-7901 细胞活性氧的生成。
图6 化合物6f 对SCG-7901 细胞内ROS 水平的影响Fig.6 Effect of compound 6f on ROS level of SCG-7901 cell
labradorin 1 是一种具有抗肿瘤活性的天然产物，实验在labradorin 1 的结构基础上采用骨架跃迁策略合成了一系列吲哚-1,3,4-二唑类衍生物，部分化合物表现出良好的抗肿瘤作用，其中化合物6f表现出最好的抗肿瘤活性，并具有一定的细胞选择性，说明酰胺的氨基部分为苄胺基团取代时活性最优。此外化合物6f 对所测试的3 种肿瘤细胞株均表现出抗增殖作用，说明化合物6f 还具有抗肿瘤谱广的特点。作用机制研究发现，该类衍生物可以诱导肿瘤细胞的凋亡和坏死。其中衍生物诱导肿瘤细胞凋亡作用可能与促进肿瘤细胞内ROS 的产生，进而造成线粒体损伤有关[15-16]。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
猜你喜欢 乙酰胺药组吲哚 吲哚美辛肠溶Eudragit L 100-55聚合物纳米粒的制备山东第一医科大学(山东省医学科学院)学报(2021年7期)2021-10-13HPV16E6与吲哚胺2，3-二氧化酶在宫颈病变组织中的表达昆明医科大学学报(2020年12期)2021-01-26格列美脲联合胰岛素治疗2型糖尿病的临床效果观察医学食疗与健康(2019年6期)2019-09-10氧代吲哚啉在天然产物合成中的应用山东化工(2019年11期)2019-06-26吲哚胺2，3-双加氧酶在结核病诊断和治疗中的作用国际呼吸杂志(2019年1期)2019-03-08百里香精油对硫代乙酰胺诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用天然产物研究与开发(2018年5期)2018-06-13复合溶剂萃取N,N-二甲基乙酰胺浙江大学学报（工学版）(2016年2期)2016-06-05水体中二氯乙酰胺以及磺胺甲恶唑对斑马鱼的毒性研究环境科技(2015年6期)2015-11-08试论补阳还五汤中黄芪与活血药组的配伍意义中国中医药现代远程教育(2014年11期)2014-08-08两个喹啉氧基乙酰胺的镧系(La、Pr)配合物的合成、表征及荧光性质无机化学学报(2014年9期)2014-02-28