孙 彤,孙竹筠,刘静宜,王培培,苏 苌,陈鸿军
(中国农业科学院上海兽医研究所 兽药评价中心,上海 200241)
尼帕病毒(Nipah virus, NiV)为副粘病毒科,亨尼病毒属,具有宿主范围广、致死率高的特点,尼帕病毒病(Nipah virus disease, NVD)为人畜共患的自然疫源性疾病,于1998年首次在马来西亚被发现,随后在新加坡、马来西亚、印度等国家暴发[1],给养猪业造成巨大经济损失,为公共卫生带来巨大威胁。2018年世界卫生组织将NVD列为对公共卫生造成严重威胁的有限疾病名单[2]。目前全球暴发的NiV感染来源于同一病毒株,该毒株在传播过程中由于遗传变异进化出马来西亚株(NiV-M)和孟加拉株(NiV-BD)[3]。人感染NiV可发生严重神经性脑炎或呼吸系统疾病,死亡率高达到40%~70%。猪感染NiV后表现为呼吸急促,发展为呼吸困难并伴随非自主性咳嗽[4],死亡率在5%左右[5]。
研究表明,NiV的传播能跨越物种障碍,可通过病毒溢出的方式感染人和其他哺乳动物。果蝠(Fruit bats)为NiV的天然宿主,是引起人和猪NiV感染的主要媒介生物[6]。曾在马来西亚、新加坡暴发的NiV感染,主要为猪场工作人员和屠宰场工人,因此猪是该病毒传播途径中重要的中间宿主:猪捡食果蝠吃剩的带毒果实感染,人接触猪后感染NiV患病,另外猪场建在果蝠栖息地边缘也可直接导致病毒传入猪群[7]。除此之外,野生动物也可通过某种途径将NiV直接传染给人[8]。目前中国还未发现NiV感染和流行的相关报道,但果蝠在云南地区活动频繁,携带大量病毒,其中包括2018年在广东暴发的猪急性腹泻综合征冠状病毒,该病毒与NiV的传播途径具有相似性[3]。中国作为养猪大国,工作人员极易通过密切接触NVD病猪引起感染,但目前仍没有针对NiV的有效预防和治疗措施,因此,需建立完善的NiV监控及检测手段,防范NiV的感染和传播。
NiV与猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪伪狂犬等病毒引起的症状相似,临床上难以区分,实验室检测是最有效的监控方法[10]。NiV属于第一类病原微生物,需在生物安全四级实验室(BSL-4)进行分离培养,一般实验室不具备处理条件。qPCR无需活病毒样本,可在BSL-2实验室进行,不易发生生物安全事故,且准确度、敏感性、特异性高,耗时短,适用于样本中NiV的快速检测及鉴定。本研究建立了针对NiVN基因的TaqMan qPCR检测技术,特异性敏感性高,稳定性好,能为NiV的临床诊断提供快速、灵敏、特异的检测方法,有效监控猪群,防止感染的发生。
1.1 核酸、病毒和质粒 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)基因组DNA、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、猪瘟病毒(Swine fever virus,CSFV)、猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus, PRV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)由中国农业科学院上海兽医研究所保存;
含N基因序列(GenBank登录号为:AJ627196.1)的重组质粒pUC57-NiVN(4299 bp),由生工生物工程(上海)有限公司合成;
AceQ U+Probe Master Mi、DL2000 Marker、T7 High Yield RNA Transcription Kit、Hiscript Ⅱ U+One Step qRTPCR kit购自南京诺唯赞公司;
病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。
1.2 引物及探针 根据保守区设计引物和探针;
扩增的目的片段为132 bp;
探针5"端标记FAM荧光报告基团,3"端标记BHQ1淬灭基团;
含T7启动子的引物,目的片段为784 bp。引物和探针由生工生物工程(上海)有限公司合成(表1)。
表1 引物和探针序列Table 1 Sequence of primers and probe
1.5 反应体系的建立与优化 采用AceQ U+Probe Master Mix说明书推荐的20 μL体系:10 μmol/L qF/R 0.4 μL,10 μmol/L Probe 0.2 μL,模板1 μL,ddH2O补足至20 μL;
反应条件:37℃ 2 min;
95℃ 5 min;
95℃ 10 s,60℃ 30 s,40个循环建立初步反应体系,在52℃~64℃范围内筛选最佳退火温度,矩阵法筛选最优引物和探针浓度,优化qPCR的反应体系。
1.6 标准曲线 将NiV 质粒10 倍系列浓度梯度(1.48×109~1.48×100copies/μL)稀释,以稀释后的各浓度质粒为模板,按照优化后的体系进行qPCR试验,每个浓度重复3次,以起始模板浓度的对数及Ct值为横纵坐标绘制标准曲线。
1.7 重复性、敏感性、特异性试验 根据绘制的标准曲线计算变异系数(coefficient of variation, CV)评估方法的重复性,确定检出限,并与常规PCR对比以评估敏感性;
以常见猪传染病病毒ASFV的基因组DNA、PRRSV、CSFV、PRV、PEDV的cDNA及健康猪血清为阴性对照,进行qPCR检测,以评价方法的特异性。
1.8 模拟临床样本检测 用健康猪血清10倍系列梯度稀释初始浓度为1.48×109copies/μL的NiV质粒,摸拟不同浓度临床样本。取梯度稀释后的模拟样本200 μL,提取DNA后取100 ng左右为模板进行qPCR试验。
1.9 体外转录制备假病毒检测 以NiV质粒为模板,用含T7启动子的引物进行PCR后得到体外转录模板,T7 High Yield RNA Transcription Kit将扩增产物体外转录为RNA,即为NiV假病毒核酸,将制备的NiV假病毒核酸按10倍梯度稀释成10个浓度作为模板(100~10-9),按优化后的引物浓度及退火温度进行qRT-PCR检测。
2.1 反应体系和反应条件的建立与优化 反应体系经优化后的最佳退火温度为64℃,最佳上、下游引物浓度为0.8 μmol/L;
探针浓度为0.5 μmol/L(Ct值=20.33±0.13)(表2)。
表2 不同探针和引物浓度下的Ct 值Table 2 Ct values at diff erent concentrations of probe and primers
2.2 标准曲线 超微量紫外分光光度计测得NiV重组质粒浓度为7 ng/μL;
根据公式y(copies/μL)=[x(g/μL)/(碱基数×660)]×6.02×1023,换算为1.48×109copies/μL,用ddH2O 10倍梯度稀释至1.48×101copies/μL。标准曲线:Y = -3.27×X+38.673,扩增效率(eff%)为102%,表明扩增效率高,R2=0.996表明不同浓度梯度模板量的对数值与Ct值之间呈现良好的相关性(图1)。
图1 标准曲线Fig.1 Standard curve
2.3 敏感性与重复性 将1.48×109~1.48×100copies/ μL的NiV重组质粒重复测定(n=3),测试该方法的重复性。结果显示CV<2%;
可检测到的最低拷贝数为14.8 copies/ μL(表3),表明方法重复性良好,结果稳定(图2),敏感性高于常规PCR(图3)。
图2 NiV qPCR 扩增曲线Fig.2 Amplif ication curve of NiV qPCR
图3 NiV 常规PCR 结果Fig.3 Conventional PCR results for NiV
表3 敏感性和重复性Table 3 Accuracy and repeatability
2.4 qPCR的特异性 用该方法检测ASFV、PRRSV、CSFV、PRV、PEDV均为阴性,仅NiV出现扩增曲线,表明该方法具有高特异性(图4)。
图4 NiV qPCR 特异性Fig.4 Specif icity of NiV qPCR
2.5 模拟临床样本检测 将拷贝数为1.48×109copies/μL的NiV质粒以健康的猪血清为基质进行10倍梯度稀释,设置7个浓度梯度,模拟不同浓度带毒血清样本进行检测。结果显示可检测到稀释度为1×10-5的样本,此时重复性降低,Ct值为37.8,但仍有明显扩增曲线(图5)。
图5 模拟样本中NiV qPCR 扩增结果Fig.5 Amplif ication of qPCR results for NiV
2.6 体外转录制备双链RNA检测 设计含T7启动子的引物,以NiV病毒质粒为模板,通过PCR后得到的扩增产物作为体外转录的模板,进行体外转录,转录产物纯化后得到的RNA为核酸,测得浓度为578 ng/μL,纯度OD260/OD280=1.8,梯度稀释后进行qRT-PCR检测,当RNA模板稀释度为1×10-7时,该方法仍表现出良好重复性,稀释度为1×10-9时仍可出现扩增曲线,但此时重复性差,易出现阴性结果(图6)。
图6 NiV qRT-PCR 扩增结果Fig.6 Results of qRT-PCR amplif ication for NiV
NiV基因组由6个转录单位和3"端的非翻译区组成,6个转录单位为N、P、M、F、G、L,分别翻译为核衣壳蛋白、磷蛋白、膜蛋白、融合蛋白、糖蛋白、大蛋白[1]。NiV的N蛋白和P蛋白可同源结合,也可异源结合形成N-P复合物[11]。副粘病毒的N蛋白为典型的螺旋或人字形结构,通常用于识别该家族的病毒[13],大多数副粘病毒N蛋白携带所谓的“不变”序列F-X4-Y-P-X3-S-Y-A-M-G,该序列同样存在于NiV N蛋白中[14],N蛋白在NiV中含量丰富,与副粘病毒亚科中其他病毒的N蛋白仅20%~30%同源性[12]。已有研究使用原核表达系统成功表达了NiV的N蛋白,且能在Western blot反应中与阳性血清反应,说明以原核表达的重组N蛋白作为检测抗原可行[15],因此N蛋白的氨基酸和基因序列在NiV的实验室诊断研究中具有重要意义。
随着国际贸易发展,NiV对中国边境的威胁日益显露,但由于其生物等级较高,分子生物诊断方法以敏感性高,易进行的优点成为NiV风险预警的重要方式。本研究根据NiVN基因中有两个ORF,能高效表达且具有高度保守性的特性,设计一对引物和探针,通过优化体系,建立的qPCR方法重复性和稳定性好,敏感性高,标准曲线线性范围为1.48×109~1.48×101copies/μL,Ct值<35,尽管模板为1.48×101copies/μL时,Ct值>35,但此时仍有典型扩增曲线且重复性良好,且该方法敏感性高于普通PCR;
特异性强,不能扩增出除NiV外其他常见猪病毒核酸。用该方法对质粒混合健康猪血清,及体外转录的RNA进行检测,可检测到1×10-5稀释度的模拟样本中NiV,及1×10-9稀释度的NiV RNA。该方法能够满足未知样本中NiV的定性及定量检测要求,且制备的体外转录双链RNA,浓度高,纯度好,无生物感染性,可作为NiV检测时的阳性对照。