沈欣悦，刘 梅，李建梅，俞 燕，范建华，戴亚斌
（江苏省家禽科学研究所，扬州 225125）
新城疫（Newcastle disease, ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）强毒株引起的一种高度接触性禽类烈性传染病。世界动物卫生组织（World Organisation for Animal Health, WOAH）将该病列为法定报告的动物疫病，我国将其列为二类动物疫病，并在《国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020）》中明确为优先防治的动物疫病。
长期以来，N D 的防控主要依赖于疫苗免疫接种。疫苗诱导产生的抗血凝素-神经氨酸酶（hemagglutinin-neuraminidase, HN）和融合蛋白（fusion protein, F）抗体在中和NDV强毒株并阻止其感染中发挥关键的作用[1]，与鸡抗病毒侵袭能力密切相关。其中，抗HN抗体可阻断病毒与宿主细胞结合，而抗F蛋白抗体则可抑制病毒与宿主细胞融合。通常将鸡血清中血凝抑制（hemagglutination inhibition, HI）抗体水平作为评判ND免疫效果的重要指标。然而越来越多的研究结果显示，虽然免疫鸡未表现明显的临床症状和死亡，但即使在HI抗体水平较高的鸡群中依然存在NDV强毒株感染与排毒现象[2-4]，成为疫病传播与流行的隐患。
20世纪90年代中期以后的较长一段时期内，由于新出现的基因Ⅶ型NDV毒株与我国广泛使用的基因Ⅱ型La Sota疫苗株之间存在明显的遗传差异和抗原差异，免疫鸡群频发非典型ND。至今基因Ⅶ型毒株在我国依然是优势流行株。2014年扬州大学利用反向遗传技术成功研制出与国内主要流行的基因Ⅶ型NDV抗原性和基因型匹配性较好的国家一类新兽药—重组新城疫病毒灭活疫苗（A-Ⅶ株），目前已在生产上广泛应用。本研究采用该疫苗免疫鸡进行了攻毒保护试验，基于不同抗体水平鸡攻毒后的临床症状与排毒情况，探讨了免疫抗体水平与免疫保护效果的相关性，为ND免疫无疫控制提 供依据。
1.1 实验动物 1日龄地方特色蛋鸡购自扬州翔龙禽业发展有限公司，购入后按常规方法隔离饲养。SPF种蛋购自浙江恒达农业发展有限公司，自行孵化至10～11日胚龄。
1.2 毒株、疫苗、抗原和血清 标准强毒F48E8株（基因Ⅸ型）和强毒株JSC0804株（基因Ⅶ型，GenBank登录号：MT162178、MT162179）由本实验室保存，其中JSC0804株分离自发病鸡群[5]。冻存的毒株经10日胚龄SPF鸡胚传代2次复壮，将尿囊液分装后，-80℃保存，同时测定病毒尿囊液ELD50以备用于攻毒试验。抗La Sota株免疫血清源于自制的灭活疫苗免疫鸡，-20℃保存。
重组新城疫病毒灭活疫苗（A-Ⅶ株，基因Ⅶ型）（以下称“A-Ⅶ株疫苗”）购自青岛易邦生物工程有限公司，鸡新城疫HI试验抗原（La Sota株）及阳性血清购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司；
鸡新城疫HI试验抗原（A-Ⅶ株）及阳性血清购自青岛易邦生物工程有限公司。
1.3 疫苗免疫 300只1日龄雏鸡购回后，定期抽取部分鸡只采集血清，采用HI试验检测NDV母源抗体水平[6]。待4周龄时鸡母源抗体效价降至2log2以下后，用A-Ⅶ株疫苗颈部皮下注射进行免疫，0.5 mL/只。为获得足够数量的高抗体效价的鸡只，部分鸡于初次免疫后3～4周再加强免疫1次。
1.4 A-Ⅶ株和La Sota株间血清学差异比较 择部分A-Ⅶ株和La Sota株疫苗免疫鸡的血清样品，同时采用A-Ⅶ株和La Sota株检测抗原进行HI试验测定抗体效价。采用GraphPad Prism软件对测定结果进行t检验，比较不同抗原检测结果，分析2个疫苗株间血清学差异。
1.5 攻毒保护试验 对不同免疫抗体水平鸡进行攻毒保护试验，根据鸡攻毒后的临床症状和排毒情况分析免疫抗体水平与攻毒保护效果的相关性。
1.5.1 分组与攻毒 鸡用A-Ⅶ株疫苗免疫后，每隔4周逐只采血，采用A-Ⅶ株检测抗原进行HI抗体检测，随即按抗体效价进行分组，每个抗体效价为一组，每组5～14只。另设2组未免疫鸡作为无免疫抗体攻毒对照组，每组10只。不同抗体效价组和对照组鸡经点眼滴鼻途径分别接种0.2 mL经稀释的NDV F48E8株或JSC0804株病毒尿囊液，1×106ELD50/只。
1.5.2 临床观察 攻毒后，每日观察和记录各组鸡发病和死亡情况，直至攻毒后15 d。其间，若发现死亡鸡只，及时进行剖检。
1.5.3 排毒检测 为了解鸡攻毒后的排毒情况，自攻毒后第1 d开始，隔天逐只分别采集口咽和泄殖腔拭子用于病毒分离，直至攻毒后15 d。采集的拭子样品置于含有750 μL样品保存液的Eppendorf管中，-80℃冻存待检。病毒分离时，待冻存的拭子样品充分融化后，将棉签在管壁上反复挤压干后弃去，加入适量青/链霉素溶液混匀后，10 000 ×g离心10 min，吸取0.2 mL上清液经尿囊腔接种10～11日胚龄SPF鸡胚，每个样品接胚2枚。鸡胚接种后置37℃继续孵化120 h，其间每日定时照胚。对于接种后24 h内鸡胚全部死亡的样品，则再次接种。收集24～120 h间死亡鸡胚以及120 h后存活鸡胚尿囊液，采用血凝（HA）试验检测其血凝性，若死亡鸡胚尿囊液HA试验结果为阴性，则继续传代2次进行确认。
1.5.4 攻毒后抗体水平检测 攻毒后15 d逐只采集存活鸡血样，采用A-Ⅶ株抗原进行HI试验测定血清中抗体效价，比较攻毒前后抗体水平变化。
2.1 A-Ⅶ株和La Sota株间血清学差异比较 A-Ⅶ株疫苗和La Sota株疫苗免疫鸡血清样品分别同时用A-Ⅶ株和La Sota株抗原进行抗体检测，结果显示，A-Ⅶ株疫苗免疫鸡血清样品用2种抗原测定的结果间差异极显著（P＜0.01），A-Ⅶ株抗原测得的抗体平均效价较La Sota株抗原抗体平均效价高（1.51±0.35）log2；
La Sota株疫苗免疫鸡血清样品用La Sota株抗原测得的抗体效价稍高于A-Ⅶ株抗原，但无显著差异（P＞0.05）（表1）。表明2种疫苗株间存在一定程度的血清学差异。
表1 两种抗原测定的免疫鸡血清HI 抗体效价比较Table 1 Comparison of serum HI antibody titers of the vaccinated chickens detected with two antigens
2.2 鸡攻毒后的临床症状 本研究中，免疫鸡的抗体效价范围为6log2～16log2，未检测到抗体效价低于6log2的鸡只。
在试验条件下，对照组鸡大多于攻毒后3 d开始出现精神沉郁、呼吸困难、饮食欲废绝、排绿色稀粪等临床症状，此后陆续死亡，其中F48E8株攻毒鸡的发病率为100%，死亡率为40%；
JSC0804株攻毒鸡发病率与死亡率均达100%。死亡鸡剖检病变基本一致，主要表现为小肠严重出血，有出血点或出血斑，脑充血、出血，符合典型ND的病变特征。所有免疫鸡攻毒后皆未表现明显临床症状，表明A-Ⅶ株疫苗免疫鸡的抗体效价达到6log2即可对鸡提供完全临床保护。
2.3 不同抗体水平鸡攻毒后的排毒情况 排毒检测结果显示，排毒率与抗体水平密切相关，不同抗体水平鸡攻毒后的排毒率总体上随抗体效价的升高呈逐渐下降的趋势。采用F48E8株攻毒，免疫鸡的抗体效价≤7log2时，排毒率达80%以上，直至抗体效价≥13log2时才未检测到排毒（表2）；
采用JSC0804株攻毒，免疫鸡的抗体效价≤9log2时，排毒情况较为严重，排毒率达70%以上，当抗体效价≥14log2时才无排毒现象（表3）。
表2 不同抗体水平免疫鸡NDV F48E8 株攻毒后排毒检测Table 2 Virus shedding detection in vaccinated chickens of diff erent antibody levels after challenge with NDV F48E8 strain
表3 不同抗体水平免疫鸡NDV JSC0804 株攻毒后排毒检测Table 3 Virus shedding detection in vaccinated chickens of diff erent antibody levels after challenge with NDV JSC0804 strain
免疫鸡的排毒基本限于攻毒后5 d内，少数抗体效价低的鸡排毒可延续至攻毒后9 d或更长时间，且前期主要为口咽排毒，后期则以泄殖腔排毒为主（表2，表3）。此外，所有对照组鸡攻毒后均有排毒现象，且排毒期较长。
2.4 鸡攻毒后抗体水平变化 攻毒后15 d的抗体检测结果显示，采用F48E8株攻毒，抗体效价为6log2～8log2组鸡攻毒后平均抗体效价较攻毒前均有不同程度上升，上升幅度随攻毒前抗体效价的增加逐渐降低；
而抗体效价≥9log2组鸡攻毒后平均抗体效价均稍低于攻毒前（图1）。攻毒后，除7log2组（16.48%）与9log2组（18.94%）的抗体效价变异系数（coefficient of variation, CV）较高外，其余各组均低于15%。
图1 免疫鸡NDV F48E8 株与JSC0804 株攻毒后15 d 抗体水平变化Fig. 1 The changes of antibody levels of the vaccinated chickens 15 days post-challenge with NDV F48E8 strain and JSC0804 strain
采用JSC0804株攻毒，抗体效价为6log2～11log2组鸡攻毒后的平均抗体效价较攻毒前有所上升，抗体效价≥12log2组鸡攻毒前后的抗体水平基本无变化。6log2～8log2组攻毒后的CV值较高（＞15%）（图1）。
虽然所有NDV毒株同属于一个血清型（血清1型），但在长期进化过程中，不同分离株间已发生了较大的遗传变异。目前，根据亲缘关系，NDV分为ClassⅠ和ClassⅡ两大类，其中Class Ⅰ中的毒株只有1个基因型（基因1型），主要来自水禽，且除个别毒株外，其余的皆为弱毒株；
ClassⅡ则分为21个基因型（基因Ⅰ～Ⅻ型），包 含强毒株和弱毒株[7]。临床ND病例均是由ClassⅡ中的强毒株引起的。与此同时，不同基因型毒株间在抗原性上也存在一定的差异[8-10]。
在20世纪40年代以后的很长一段时间内，由于疫苗的广泛使用，ND的发病率和死亡率均得到了较好的控制，但随着基因Ⅶ型毒株逐渐成为我国的优势流行株，临床上非典型ND病例十分普遍。在排除免疫程序不合理、免疫抑制病等因素外，疫苗株与流行株的基因型和抗原性不匹配可能是ND免疫失败的主要原因之一。交叉中和试验结果显示，B1/46和Clone30疫苗株与基因Ⅶ型分离株间抗原性相关（relatedness, R）值为0.15～0.51[11]，La Sota株与重组基因Ⅶ型毒株aSG10间的R值为0.23[12]，表明常用的La Sota株等基因Ⅱ型疫苗株与基因型Ⅶ型毒株间在遗传学和抗原性方面均有较大的的差异。尽管有一些研究者认为，对于具有免疫活性的鸡，疫苗株与流行株不匹配并不是ND免疫失败的主要原因[13-15]，但众多研究结果已证实，虽然常规疫苗和与流行株基因型匹配的疫苗对流行株均可提供良好的临床保护效果，但后者可显著降低感染鸡的排毒量[16-20]。与常规La Sota株疫苗相比，A-Ⅶ株疫苗不仅能有效降低免疫鸡攻毒后的排毒率，而且能显著减少口咽和泄殖腔中的病毒载量，排毒高峰时的病毒量可降低10倍以上[20]。
本研究结果表明，A-Ⅶ株和La Sota株2个疫苗株间存在一定的血清学差异。抗A-Ⅶ株血清用A-Ⅶ株与La Sota株抗原测得的结果有极显著的差异，同源抗原所测结果显著高于异源抗原，平均相差1.51log2。而抗La Sota株血清采用同源和异源抗原测得的HI抗体效价差异则不显著。这与Yang等[12,21-22]报道的结果基本一致，提示在临床上应采用与疫苗株同源的检测抗原进行抗体检测，以免影响疫苗免疫效果评价。
本研究模拟自然感染途径，采用基因Ⅸ型标准强毒株F48E8和基因Ⅶ型分离株JSC0804对A-Ⅶ株疫苗免疫鸡进行攻毒保护试验，结果表明，当免疫鸡的抗体效价达到6log2即可对鸡提供完全临床保护，这与其他研究者的试验结果基本一致。刘秀梵等[23]采用A-Ⅶ株疫苗免疫蛋雏鸡，免疫6个月后鸡的HI抗体效价仍可保持≥6.1log2，且抽样攻毒后的保护率为100%。然而，本研究中虽然A-Ⅶ株疫苗可对鸡提供良好的临床保护效果，但免疫鸡攻毒后表现不同程度的排毒现象，排毒率与HI抗体效价密切相关，总体上随免疫抗体效价的升高而逐渐下降，抗体效价分别在≥13log2和≥14log2时才能完全阻止F48E8株和JSC0804株排毒。此外，免疫鸡排毒一般仅限于攻毒后5 d内，仅有个别抗体水平较低的鸡可延续至攻毒后9 d或更长时间。汪文斌等[24]报道La Sota株疫苗免疫抗体效价≥4log2时可对F48E9强毒株攻击产生完全保护。徐江涛[25]报道La Sota株疫苗免疫抗体效价在6log2以上时对基因Ⅶ型流行株的保护率可达100%。Yang等[12]对La Sota株和重组基因Ⅶ型aSG10株疫苗免疫鸡进行了基因Ⅶ型强毒株SG10株攻毒保护试验，攻毒后5 d采集泄殖腔拭子进行鸡胚病毒分离作排毒检测，结果表明，当La Sota株疫苗免疫后HI抗体效价≥7log2（肌内攻毒）或≥8log2（点眼滴鼻攻毒）时可完全抑制排毒，aSG10株疫苗免疫后则在抗体效价≥5log2或≥7log2时可完全抑制排毒。这与本研究结果有较大的差异，可能与疫苗株以及排毒检测的时间节点和采集拭子样品种类不尽一致等因素有关。虽然本研究未对排毒量进行定量分析，但包括本研究在内的上述研究结果可以证实其他一些研究者[13-15,23]的观点，即无论疫苗株与流行株的基因型是否匹配，只要鸡具有良好的免疫应答均可提供有效的临床保护，在HI抗体效价足够高的情况下，也可阻止强毒株的感染和排毒。虽然本研究结果显示完全抑制排毒所需的抗体效价较高，但A-Ⅶ株疫苗具有良好的免疫原性，诱导的抗体水平较La Sota株疫苗高[21]。我们另外的疫苗免疫试验结果（本文未列出）也显示，采取同样的免疫程序，A-Ⅶ株疫苗诱导产生的抗体效价在各时间点上较La Sota株疫苗高2.2log2～4.6log2，平均约高3.5log2，且高抗体水平维持时间也较长。
临床上有时会采用双份血清（发病初期和恢复期）检测的方法对ND进行血清学诊断，若鸡群恢复期血清抗体水平较发病初期显著升高，且CV值增大时，可判定鸡群有强毒株感染。文其乙等[26]对La Sota株弱毒活疫苗免疫鸡进行了强毒株攻毒试验，比较了平均HI抗体效价为5.63log2～6.30log2的鸡攻毒前后抗体水平的变化，攻毒前免疫鸡的抗体效价CV值均小于10%，攻毒后25 d各组CV值则增加到20%左右，这与本研究结果基本一致。然而，本研究中高抗体水平组的鸡攻毒后即使有排毒现象，但抗体水平未见明显升高，CV值也较低，表明它们虽可感染，但并未产生明显的抗体反应。因此，对于免疫抗体水平较高的鸡群，双份血清检测方法不一定完全适用于NDV强毒株感染的诊断。
总之，在本实验条件下，A-Ⅶ株疫苗对同源和异源强毒株感染均可提供良好的临床保护，在HI抗体水平足够高的情况下，也完全可以阻止强毒株的感染和排毒。但在生产实际中，要在鸡群整体水平上达到并长期保持不感染强毒株或感染后不排毒的抗体水平很难实现。本研究采用连续免疫2次的方法也仅是获得少量高抗体效价的鸡只。因此，在ND防控中要正确认识免疫的作用。免疫的目的主要有3个：一是减少或消除临床病例；
二是降低强毒株感染后排毒量；
三是提高强毒株建立感染的剂量[27]。若要从根本上控制和消灭ND，除选择适合的疫苗并采取合理的免疫程序以尽可能提高鸡群抗体水平外，更主要的是应加强养殖场的生物安全管理，减少或消灭鸡群中的强毒株，同时阻止外界强毒株进入鸡群，最终达到控制ND的目的。