钱炳旭，薄宗义，白雪雁，张成成，郭梦娇，李梦娇，廖 凯，薛 峰，吴艳涛，张小荣
（1.扬州大学兽医学院 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225000；
2.南京农业大学动物健康与食品安全国际合作实验室，南京 210095；
3.扬州大学农业科技发展研究院教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室，扬州 225000）
猪德尔塔冠状病毒（Porcine delta coronavirus,PDCoV）是近年来新发的冠状病毒，2012年在中国香港被首次报道[1]，2014年在美国首次出现大规模流行[2-3]。PDCoV在临床上主要引起仔猪腹泻，且常与PEDV发生混合感染，给全球养猪业造成较大经济损失。2015年，PDCoV在我国开始流行蔓延，黑龙江[4]、广西[5]、四川[6]和山东[7]等省份均有检出，现已是国内病毒腹泻类疾病的防范重点，对国内养猪业有较大威胁[8]。
PDCoV属于冠状病毒科，δ冠状病毒属，是有囊膜的、不分节段的单股正链RNA病毒，病毒粒子呈多形性，内部基因组RNA和核衣壳（nucleocapsid,N）蛋白组成了核蛋白核芯[9]。N蛋白在病毒粒子组装过程中与膜（membrane, M）蛋白相互作用，提高 病毒的转录和组装效率[10]，也可促进病毒样颗粒（virus-like particles, VLPs）的产生和基因组RNA的合成，提高病毒的复制效率[11-12]。贾雪霞等[13]使用慢病毒表达系统构建了稳定表达小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus, PRRV）N蛋白的Vero细胞系，N蛋白表达丰度大，为小反刍兽疫的诊断、鉴定以及新型基因重组疫苗的开发奠定了基础。PDCoV N蛋白在病毒感染早期即可产生，丰度最大，免疫原性强，在不同毒株之间高度保守，而PDCoV感染的早期诊断对疫情防控具有重要意 义，因此，N蛋白常作为PDCoV血清学检测方法的靶蛋白[14]。
本研究拟构建稳定表达PDCoV N蛋白的Vero细胞系，并对其在PDCoV血清学检测方法中的应用进行初步摸索，以探究PDCoV N蛋白的生物学特性，为PDCoV临床诊断和流行病学调查奠定基础。
1.1 载体与菌株 慢病毒载体pLVX-EF1α-IRESPuro及相应的辅助质粒psPAX2、pMD2.G购自美国Addgene公司；
大肠杆菌Stbl2感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。
1.2 毒株、细胞与抗体 PDCoV CHN/Tianjin/2016株由本实验室分离、鉴定并保存[15]；
HEK-293T细胞保存于本实验室；
Vero细胞（CCL-81）购自ATCC；
PDCoV N蛋白的鼠源单克隆抗体、PDCoV阳性血清和猪阴性血清由扬州大学兽医学院传染病重点实验室制备和保存[16]。
1.3 主要试剂 T4 DNA连接酶、限制性内切酶和Lipofectamine®3000脂质体转染试剂均购自Thermo公司；
辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）标记的羊抗鼠IgG、兔抗猪IgG抗体、异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）标记的羊抗鼠IgG抗体和羊抗猪IgG抗体均购自美国Sigma公司；
小量提取质粒试剂盒与胶回收试剂盒均购自美国Axygen公司；
FBS和DMEM均购自美国Gbico公司；
CCK-8试剂购自美国APExBIO公司。
1.4 慢病毒表达质粒的构建 根据PDCoV CHN/Tianjin/2016株N基因序列（GenBank登录号：KY065120），去掉末端终止密码子TAG，使用生物学软件Primer Premier 5，设计剩余碱基序列的引物，为方便克隆和后续的鉴定，基因片段两段分别添加BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶识别位点，同时在下游引物添加FLAG标签（表1）。提取PDCoV的总RNA，使用表1的引物进行RT-PCR，胶回收PCR产物并测序。将测序鉴定正确的目的基因PDCoV-N克隆入慢病毒载体pLVX-EF1α-IRES-Puro的多克隆位点中，经酶切鉴定正确后转化入大肠杆菌Stbl2感受态细胞中，-70℃保存。
表1 引物序列Table 1 Primers sequences
1.5 慢病毒的包装 使用去内毒素质粒提取试剂盒提取慢病毒表达质粒pLVX-EF1α-IRES-Puro-PDCoV-N，并与辅助质粒 pMD2.G和辅助质粒psPAX2组成三质粒包装体系，pLVX-EF1α-IRESPuro-PDCoV-N、pMD2.G和psPAX2的质量比为7:2:1，质粒总质量15 μg，用Lipofectamine®3000脂质体转染试剂共转染1个100 mm dish的HEK-293T细胞中，进行慢病毒的包装，包装48～72 h后收集慢病毒，1000 ×g离心10 min，弃去底部细胞沉淀，提取病毒RNA，以表1的引物进行RT-PCR鉴定，鉴定正确的慢病毒保存于-70℃。
1.6 Vero细胞嘌呤霉素筛选浓度的确定 接种适当数量的Vero细胞至24孔细胞板内，加入生长液（10% FBS-DMEM），待细胞长满，弃去孔中生长液，换成嘌呤霉素筛选培养基（生长液里添加嘌呤霉素），设立0～8 μg/mL的嘌呤霉素浓度梯度，每个浓度设3个平行，间隔2 d更换一次嘌呤霉素筛选培养基，4 d后使用CCK-8测定细胞活性，选取4 d内完全杀死Vero细胞的嘌呤霉素浓度为筛选浓度。
1.7 细胞系的获取及RT-PCR鉴定 慢病毒感染Vero细胞48 h后，将培养基换成嘌呤霉素筛选培养基，同时设立Vero细胞对照。间隔2 d更换一次筛选培养基，待对照孔内细胞全部死亡、脱落，将接毒孔内细胞全部转出至12孔细胞板上的另1个空白孔内，用筛选培养基进行2次筛选，细胞长满后弃去4/5底面积的细胞继续筛选传代，如此加压筛选4～5代后，获得的重组细胞系能在嘌呤霉素筛选培养基中稳定生长，命名为Vero/PDCoV-N。选取第5、10、15和20代的细胞系Vero/PDCoV-N，提取细胞总RNA，以表1的引物进行RT-PCR鉴定，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察、拍照。
1.8 细胞系的Western blot鉴定 选取第5、10、15和20代的细胞系Vero/PDCoV-N，提取细胞总蛋白，以PDCoV N蛋白的单克隆抗体为一抗（1∶2000稀释），羊抗鼠IgG-HRP酶标抗体为二抗（1∶5000稀释），进行Western blot分析。
1.9 细胞系的间接免疫荧光试验（indirect immunof luorescence assay, IFA）鉴定 分别将第5、10、15和20代的细胞系Vero/PDCoV-N铺于12孔细胞板，同时设Vero细胞系为阴性对照，16～18 h后，待细胞长满，以PDCoV N蛋白的单克隆抗体为一抗（1∶500稀释），羊抗鼠IgG-FITC荧光抗体为二抗（1∶100稀释），进行IFA鉴定，荧光显微镜下观察。
1.10 细胞系的初步应用 取适量细胞系Vero/PDCoV-N接种于12孔细胞板内，待细胞长满后（约16～18 h），以临床样品血清为一抗（1∶500稀释），羊抗猪IgG荧光抗体为二抗（1∶100稀释），对实验室保存的临床样品血清进行IFA检测，并与原核表达的PDCoV N蛋白作为包被抗原的间接ELISA的检测结果进行对比。
2.1 慢病毒的RT-PCR鉴定 提取包装的慢病毒总RNA，设ddH2O的阴性对照和慢病毒表达载体pLVX-EF1α-IRES-Puro-PDCoV-N的阳性对照，用表1的引物进行RT-PCR，结果可知，慢病毒基因组cDNA的泳道可观察到1074 bp的目的条带（图1），表明PDCoVN基因成功插入慢病毒基因组内。
图1 慢病毒的RT-PCR 鉴定Fig.1 Identif ication of Lentivirus by RT-PCR
2.2 Vero细胞嘌呤霉素筛选浓度的确定 生长液中添加嘌呤霉素，设立浓度梯度，4 d内可完全杀死Vero细胞的嘌呤霉素浓度为筛选浓度，结果显示，在嘌呤霉素浓度≥4 μg/mL时Vero细胞在4 d内全部死亡，无法存活。因此以4 μg/mL的嘌呤霉素浓度为筛选浓度。
2.3 细胞系的获取及RT-PCR鉴定 慢病毒感染Vero细胞，经嘌呤霉素（4 μg/mL）加压筛选4～5代后，感染细胞可在嘌呤霉素培养基中稳定贴壁生长，将具有嘌呤霉素抗性的细胞系命名为Vero/PDCoV-N。分别收取第5、第1 0、第1 5 和第2 0 代次V e r o/PDCoV-N细胞样品，提取它们的总RNA，设Vero细胞基因组RNA为阴性对照，慢病毒载体pLVXEF1α-IRES-Puro-PDCoV-N为阳性对照，以表1的引物进行RT-PCR鉴定，可见细胞系Vero/PDCoV-N有1074 bp的目的条带（图2），与预期相符，表明PDCoVN基因已插入细胞系Vero/PDCoV-N的基因组内。
图2 细胞系Vero/PDCoV-N 的RT-PCR 鉴定Fig.2 Identif ication of cell line Vero/PDCoV-N by RT-PCR
2.4 细胞系的Western blot鉴定 分别收取第5代、第10代、第15代和第20代次Vero/PDCoV-N细胞样品，提取细胞蛋白，以PDCoV N蛋白的单克隆抗体为一抗，羊抗鼠IgG-HRP酶标抗体为二抗，进行Western blot分析。结果表明，不同代次的细胞系中均可检测到大小为39 kDa的特异性条带，说明其成功表达PDCoV N蛋白（图3）。
图3 细胞系Vero/PDCoV-N 的Western blot 分析Fig.3 Western blot analysis of cell line Vero/PDCoV-N
2.5 细胞系的IFA鉴定 分别将第5、10、15和20代的细胞系Vero/PDCoV-N铺于12孔细胞板，同时设Vero细胞系为阴性对照，16～18 h待细胞长满后，以PDCoV N蛋白的单克隆抗体为一抗（1∶500稀释），羊抗鼠IgG-FITC荧光抗体为二抗（1∶100稀释），进行IFA鉴定。荧光显微镜下观察，不同代次的细胞系均可发出特异性的绿色荧光信号（图4），表明细胞系Vero/PDCoV-N可成功表达PDCoV N蛋白。
图4 细胞系Vero/PDCoV-N 的间接免疫荧光鉴定Fig.4 Identif ication of cell line Vero/PDCoV-N by IFA
2.6 细胞系的初步应用 将细胞系Vero/PDCoV-N适量接种于12孔细胞板内，PDCoV阳性和阴性猪血清为一抗，羊抗猪IgG荧光抗体为二抗，进行IFA试验，并与 原核表达的PDCoV N蛋白作为包被抗原的间接ELISA的检测结果对比（表2），两个方法的阴阳性符合率均为100%（20/20），表明细胞系Vero/PDCoV-N其表达的N蛋白具有良好的反应原性。
表2 间接免疫荧光试验检测结果Table 2 Test results of IFA
目前已经有多种PDCoV的血清学检测方法，Su等[17]将PDCoVN基因克隆入pET-32a载体中，通过大肠杆菌原核表达系统，制备了PDCoV N重组蛋白，以其作为包被抗原建立了间接ELISA法，对已知背景的样品（n=62）进行检测，灵敏度为100%，特异性为90.4%，并应用该方法对319份临床样品进行检测，结果显示11.59%的样品为PDCoV抗体阳性。该研究表达的N蛋白呈包涵体状态，虽然仍具有较好的特异性，但包涵体蛋白的制备过程存在步骤繁琐，需要变性和复性，容易复性失败等缺点，为实际操作增加了困难。张帆帆等[18]利用低温表达载体pColdⅠ成功表达了可溶性PDCoV N蛋白，大大简化了蛋白表达纯化的步骤，同样建立了间接ELISA检测方法，具有良好的特异性和重复性，对收集自江西各地区282份猪血清进行检测，阳性率为12.8%（36/282），表明PDCoV在江西省猪群中普遍存在。虽然大肠杆菌表达系统具有产量高，成本低和操作简单等优点，但其表达的蛋白容易呈现包涵体状态，且缺少后期的蛋白修饰，无法完全还原蛋白的天然结构。
慢病毒表达系统是常见的建立表达外源基因细胞系的工具，具有操作简单、转染效率高和生物安全性好等优点[19]。N蛋白在病毒复制过程中起着重要的作用[11]，殷倩倩等[20]将感染性克隆质粒与N蛋白质粒共转染进Vero细胞，获得了重组小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV），病毒滴度可达106.2TCID50/mL，可作为一个标记疫苗的候选株。本研究使用的慢病毒载体pLVX-EF1α-IRES-Puro及其辅助质粒上包含了包装、转染、稳定整合所需元件，将克隆入PDCoVN基因的载体转染哺乳细胞293T包装慢病毒，通过慢病毒感染Vero细胞，将外源PDCoVN基因整合入细胞基因组内，并随宿主细胞的分裂而扩增。经嘌呤霉素的加压筛选、纯化获得的细胞系与瞬时转染相比，其能实现PDCoV N蛋白长期、稳定的表达，且能完全还原N蛋白的空间结构，为PDCoV反向遗传平台建立和N蛋白生物学特性研究奠定了基础。
以间接免疫荧光和细胞免疫组化等方法检测PDCoV血清样品时，需要病毒感染细胞，待细胞病变后进行下一步试验，在实际操作的过程中步骤繁琐，时间冗长，并不简便，且PDCoV的分离培养较为困难，存在生物安全风险，有条件获取毒株的实验室相对较少[21]。本研究建立的细胞系Vero/PDCoV-N可长期稳定的表达N蛋白，代替抗原检测临床样品血清，可避免前期病毒分离的麻烦，也省去了病毒感染细胞产生病变的过程，大大缩短了IFA等试验所需时间，具有一定的应用前景。将长满的细胞板孔内的细胞消化下来，计数后裂解所有细胞提取总蛋白，使用本实验室已建立的PDCoV N蛋白双抗体夹心ELISA方法对其进行检测[16]，读取OD450值，根据已建立的OD450值-N蛋白含量标准曲线，确定N蛋白含量，再绘制细胞数量-N蛋白含量标准曲线，之后即可根据各种规格细胞板对应的细胞数量确定N蛋白含量。同理，按上述方法也可检测细胞生长不同时间段的N蛋白表达水平，以了解细胞系的N蛋白表达，用于之后建立标准的检测方法。本研究建立的细胞系Vero/PDCoV-N有助于推动对PDCoV N蛋白功能和特性的深入研究，为建立一个新的PDCoV抗体检测平台奠定了基础，有益于PDCoV感染的快速诊断和流行病学调查。
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