周婷婷，翁一如，叶恭杰
甲状腺癌（thyroid carcinoma，TC）是最常见的内分泌恶性肿瘤，占每年新诊断癌症的3.4%[1]。而高分化甲状腺癌（highly differentiated thyroid cancer，WDTC）又占TC 病例的大部分[2]。手术切除是大多数TC 患者的标准治疗方法。低风险WDTC 患者可单纯通过手术治疗，而高风险WDTC 患者可能需要结合抑制促甲状腺素（thyroid stimulating hormone，TSH）和放射碘治疗（radioiodine therapy，RAI）[3]。目前晚期TC 患者生存期较差，表明缺乏有效的治疗策略。因此，寻找优质的生物标志物对TC 的诊疗具有重要意义。
层粘连蛋白B 受体（lamin B receptor，LBR）基因编码的蛋白属于甾醇还原酶基因4/甾醇还原酶基因24（sterol reductase 4/sterol reductase 24，ERG4/ERG24）家族，定位于核膜内，它可能介导与染色质和层蛋白B 之间的相互作用，影响骨骼发育[4]。研究表明LBR在细胞分裂、分化和增殖中具有重要意义，且参与DNA复制、细胞周期进程和基因沉默过程[5]。尽管LBR在基因转录调控方面具有强大功能，但其在肿瘤中的作用机制尚不明确。本研究拟通过癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库对比LBR 在TC 与癌旁的表达，分析LBR 表达与亚型之间的关系，并明确甲基化调控LBR 表达以及与免疫浸润的关系，探究LBR 与TP53 之间的表达关系，现报道如下。
1.1 一般资料 选择来源于TCGA数据库的RNAseq 数据，利用DNA 甲基化交互式可视化数据库（DNA methylation interactive visualization database，DNMIVD）网站进行甲基化分析；
在时代2.0（Timer2.0）网站进行免疫浸润分析。
细胞与试剂：人甲状腺癌乳状细胞（BcPAP）细胞系购自普诺赛生物科技公司，抗体Anti-Lamin B Receptor/LBR antibody [E398L]（货号：ab32535，Abcam）、p53（1C12）Mouse mAb（货号：2524，CST），辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠（货号：SA00001-1，PTG）、HRP 标记羊抗兔（货号：SA00001-2，PTG）、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）溶液（货号：28718-90-3，索莱宝）、二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒（20x）（货号：DA1010，索莱宝）、荧光素5-异硫氰酸酯（FITC）标记羊抗鼠（货号：SA00003-1，PTG）、花青靛染3（CY3）标记羊抗鼠（货号：SA00009-2，PTG）。免疫组化：选取一对高分化II 型TC 与癌旁组织进行免疫组化实验。本研究经宁波市医疗中心李惠利医院医学伦理委员会批准。
1.2 方法
1.2.1 数据获取 应用R 包“TCGA-biolinks”下载和读取TCGA RNA-seq数据，提取“每千个碱基的转录每百万映射读取的转录本数（TPM）”测序数据，临床信息包括亚型、治疗及生存等，形成表达矩阵；
R版本：R version 4.2.2。
1.2.2 差异分析和相关性分析 读取上述获得基因表达矩阵，并进行癌与癌旁分组，加载“DESeq2”包，构建DESeq2 所需的DESeqDataSet 对象，过滤掉低表达的基因；
使用DESeq 进行差异表达分析，并使用ggplot 提取、分析LBR 基因表达差异并作图。
1.2.3 受试者操作特征曲线（ROC）分析 使用pROC 和ggplot2 包在R 语言中绘制ROC 曲线。
1.2.4 甲基化分析 利用DNMIVD（http://119.3.41.228/dnmivd/index/）网站，以关键词：LBR；
thyroid carcinoma进行分析，通过皮尔逊（Pearson）相关性分析并做图。
1.2.5 免疫浸润分析 免疫浸润分析在Timer2.0 网站（http://timer.cistrome.org/）进行，进入免疫评估模块，以输入基因：LBR；
免疫亚群，进行LBR 基因表达与免疫各亚群的相关性分析，筛选相关性系数r＞0.4 的免疫亚群进行展示。
1.2.6 免疫荧光 将BcPAP 细胞铺入细胞爬片中培养2 d 后，使用多聚甲醛固定，用磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗，使用Triton X-100 破膜、牛血清白蛋白（BSA）封闭，一抗过夜，FITC 或CY3 标记的二抗孵育，DAPI 染色，显微镜获取图片。
1.2.7 免疫组化 将高分化II 型TC 与癌旁组织放入4%的甲醛中固定1 周，取出放入正丁醇中脱水处理，并经石蜡包埋处理，制作石蜡切片。在55 ℃的恒温箱中烤片30 min，把切片放入脱蜡液中，依次用脱蜡液、无水乙醇处理，并用流水冲洗，完成脱蜡和水化；
把切片放入3%双氧水中，孵育5 ～10 min，并用流水清洗，致使内源性过氧化物酶灭活；
使用微波炉加热，进行抗原修复，高火2 min，两次；
使用5%的山羊血清室温封闭30 min；
4 ℃孵育一抗LBR 抗体、TP53 抗体过夜；
用PBS洗3 次；
二抗孵育室温1h；
用PBS 洗3 次后，DAB 溶液显色30 s，洗去DAB 工作液，使用苏木素进行复染，用流水清洗，将切片置于无水乙醇中浸泡10 s，高温干燥；
加入中性树脂封片。
1.3 统计方法 采用SPSS 25.0统计软件进行分析，使用配对t 检验分析TC 与癌旁组织的LBR 表达差异，LBR 与TP53 共表达的相关性采用线性分析，LBR 表达的检验效能分析采用ROC 曲线分析。P＜0.05 表示差异有统计学意义。
2.1 LBR 基因在甲状腺癌中的表达 RNA-seq 数据来源于TCGA 数据库，其中TC 患者571 例，癌旁组织59 例，结果显示LBR 在TC 中低表达（P ＜0.05），见封三图1；
LBR 在TC 中低于癌旁（P ＜0.05），见封三图2；
LBR 在经典型PTC 中高于滤泡型，癌旁高于PTC任何亚型（均P ＜0.05），见封三图3。ROC 曲线分析结果显示LBR 在TC 诊断中有较好的诊断效果（AUC=0.80，95%CI：0.74 ～0.86）。
图1 LBR在TC中的表达
图2 LBR在TC与癌旁组织中的表达比较
图3 LBR在各个TC亚型中的表达
2.2 LBR低表达与高甲基化的相关性 LBR启动子区的甲基化检测发现位点cg02825765、cg24834199 甲基化水平与LBR表达均呈负相关（r=－0.27、－0.03，均P ＜0.05），见图1。LBR 表达与嗜酸性粒细胞、辅助型T 细胞及中央记忆型T 细胞浸润均呈正相关（r=0.45、0.53、0.41，均P ＜0.05），见图2。
图1 LBR 与甲基化的相关性
图2 LBR 与免疫浸润的相关性
2.3 LBR低表达与TP53 相关并存在共定位情况免疫荧光检测发现LBR 与TP53 在细胞核中共定位，见图3；
免疫组化检测显示TP53、LBR 在肿瘤中均低表达，见图4；
此外，相关性分析发现LBR 与TP53 呈正相关（r=0.47，P ＜0.05），见图5。
图3 免疫荧光图（标尺=100 m）
图4 甲状腺癌免疫组化图（DAPI 染色，×400）
图5 LBR 表达与TP53 的相关性
TP53 是一种抑癌因子，在细胞周期、DNA 修复和凋亡中具有多方面的调节功能[6]。失活的TP53 突变已在约50%的人类癌症中被鉴定[7]。这些突变不仅在肿瘤进展中很重要，而且对一些肿瘤的化疗和放疗反应也很重要[8]。TP53 突变见于14%的恶性甲状腺肿瘤，在低分化和间变性肿瘤中更常见。此外，辐射相关TC 的TP53 突变率（15.4%）与自发性肿瘤相似，尽管在两组肿瘤中突变的残基存在非常显著的异质性[9]。在辐射相关TC 中突变的残基均未涉及CpG 脱氨。根据TP53 超变异性的证据，TC 似乎表现出显著的基因组不稳定性。本研究发现TP53表达、定位与LBR 相关；
然而，两者的调控关系需要后序实验证明。
以往研究表明，LBR 表达与组织分化和发育有关，Solovei 等[10]发现在小鼠模型中，LBR 的表达下调导致核外周异染色质的缺失。部分研究报道LBR选择性与异染色质或Lamin B TUDOR 结构域相互作用，诱导染色质压缩和抑制转录。染色质致密化可通过与特定组蛋白修饰标记的染色质区域结合，如二甲基化的Lys 20 组蛋白H4（H4K20me2）而介导。虽然压缩本身会导致转录抑制，但LBR 也会招募转录抑制因子，如HP1 等。另一方面，异染色质的形态和定位是调控肿瘤发生、发展的关键因素，Zhu 等[11]研究发现BRCA1 蛋白具有促进泛素化修饰的组蛋白H2A 在臂间异染色质区域富集的作用，BRCA1缺失导致异染色质的异位，并导致卫星DNA转录激活，DNA 断裂等基因组失稳表型，而LBR 低表达是否与甲状腺基因组稳定以及发生有关有待研究。此外，Tiago 等[12]发现在小热休克蛋白HSPB3 可以通过结合LBR 并抑制其在核膜的定位，增加肌生成。而肌生成相关基因表达如SYNPO2、MYH2 与肿瘤抑制有关[13]，这提示LBR 低表达可能与低分化TC 的发生及发展有关。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 周婷婷：实验操作、论文撰写；
翁一如：数据整理、统计学分析；
叶恭杰：研究指导、论文修改、经费支持