于光远,王俊淑,项雯鑫,钟红群,田 莹,檀 军,张继东
(1.遵义医科大学 组织胚胎学教研室,贵州 遵义 563099;2.遵义医科大学医学与科技学院 基础医学院,贵州 遵义 563099; 3.遵义医科大学 形态学实验室,贵州 遵义 563099;4.遵义医科大学 免疫学教研室,贵州 遵义 563099)
锰(manganese,Mn)常见于泥土[1]、河流[2]等,经由呼吸道[3]与消化道[4]进入人体。作为一种必需的微量元素,锰在激素分泌、精子发生等生理过程中起着至关重要的作用[5-6];但是随着在体内蓄积至过量,锰可损伤神经系统[7]、消化系统[8]和生殖系统[9]等,其中对男性生殖系统的损伤较为严重。
精子发生是一个复杂的过程,它依赖于稳定的激素水平[9]。睾酮在睾丸间质细胞中经过一系列酶促反应产生,并且受到下丘脑-垂体-睾丸轴调控,垂体分泌的卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)和黄体生成素(luteinising hormone,LH)与睾丸间质细胞的受体结合,调控睾酮生成。
研究表明,锰可降低血清睾酮浓度从而影响精子发生[10-11]。九香虫是一种传统中药,具有较好的药用价值和经济价值,其提取液可提高锰暴露大鼠血浆睾酮浓度[12]。然而,九香虫的售价相对较高,养殖它们极为困难,并且它们有蚂蚁、蜘蛛等天敌,因此其数量正在急剧减少。相较于虫药,草药在资源丰富性和成本效益方面具有明显的优越性。淫羊藿苷(Icraiin,ICA)是一种异戊烯基黄酮醇苷类化合物,是我国传统中草药淫羊藿的主要活性成分之一,研究表明,ICA可显著提高大鼠血清睾酮浓度[13]。但ICA能否提高锰暴露大鼠血清睾酮浓度尚不明确。为探究ICA是否提高锰暴露睾丸间质细胞功能以及其机制,本研究通过建立动物与细胞实验模型分析ICA干预锰暴露睾丸间质细胞睾酮合成的分子机制。
1.1 材料
1.1.1 实验动物 9只8周龄健康雄性SD大鼠购自遵义医科大学实验动物中心,体重220～270 g,生产许可证号:SYXK(黔)2021-0004,动物伦理审查编号ZMU21-2306-108。动物实验环境为SPF级动物房,12 h/12 h光暗循环,温度(24±1)℃,湿度(50±10)%。
1.1.2 细胞株 小鼠睾丸间质细胞(TM3细胞株)购自中国科学院细胞库。TM3细胞在DMEM/F12完全培养基中培养,放置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中,细胞增殖到培养瓶底面70%～80%时进行传代。
1.1.3 主要试剂 PBS购自武汉赛维尔生物科技有限公司;ELISA试剂盒购自武汉云克隆科技股份有限公司;淫羊藿苷(Icariin,ICA)和四水氯化锰晶体(MnCl2·4H2O)购自上海易恩化学技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 实验试剂配制 将DMEM/F12基础培养基、胎牛血清、马血清和青链霉素混合液按照91.5%、2.5%、5%、1%的比例混合配成DMEM/F12完全培养基;将19.8 g MnCl2·4H2O晶体溶于800 ml H2O,定容到1 L配成MnCl2母液,用生理盐水稀释MnCl2母液;将0.338 5 g ICA溶于10 ml二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO),配成ICA溶液(浓度为50 mmol/L),用DMSO稀释ICA溶液;将4 g ICA与100 ml PBS混合配成ICA悬液。
1.2.2 SD大鼠分组与处理 将SD大鼠随机分为3组:对照组、模型组、ICA干预组,适应性饲养1周;模型组和ICA干预组连续4周(每周5 d)腹腔注射MnCl2·4H2O 30 mg/(kg·d),对照组腹腔注射等体积生理盐水;随后ICA干预组连续2周灌胃ICA 100 mg/(kg·d),对照组和模型组灌胃等体积PBS。
1.2.3 HE染色观察组织形态学变化 给药结束后,颈椎脱臼处死大鼠,取睾丸组织置于4%多聚甲醛固定24 h,经梯度乙醇脱水,二甲苯透明。石蜡包埋睾丸组织,制作厚度为5 μm切片,45 ℃水浴展片并贴片。脱蜡、苏木素染色2 min,用纯水浸泡1 min,盐酸乙醇分化3 s,用流水冲洗1 min,伊红染色30 s,常规脱水、透明及封片。使用显微镜观察睾丸组织形态变化并拍照。
1.2.4 血清睾酮含量测定 给药结束后,颈椎脱臼处死大鼠,迅速心脏取血,静置10 min,10 000×kg离心10 min后取上层血清,分装储存。依照ELISA检测试剂盒说明书检测睾酮的含量。
1.2.5 睾丸组织StAR、P450scc和3β-HSD基因表达检测 取大鼠睾丸组织充分研磨,Trizol法提取睾丸总RNA,测定总RNA的浓度,将RNA逆转录合成 cDNA,以cDNA 为模板,按PCR试剂盒操作步骤进行扩增反应,扩增条件为94 ℃变性 30 s,58 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 20 s,40个循环。以GAPDH 为内参,用2-ΔΔCt法计算睾丸组织StAR、P450scc和3β-HSD的mRNA相对表达量。在NCBI上检索得到StAR、P450scc、3β-HSD和内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的cDNA序列,编号分别为NM_031558.3、NM_017286.3、NM_001007719.3和NM_017008.4,设计引物并进行评价。委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行引物合成。基因引物序列如表1所示。
表1 扩增基因引物序列
1.2.6 MTT法检测TM3细胞活性 实验分组为对照组(0 mmol/L Mn2++0 μmol/L ICA)、模型组(1 mmol/L Mn2++0 μmol/L ICA)、ICA干预组Ⅰ(1 mmol/L Mn2++0.08 μmol/L ICA)、ICA干预组Ⅱ(1 mmol/L Mn2++0.4 μmol/L ICA)、ICA干预组Ⅲ(1 mmol/L Mn2++2 μmol/L ICA)、ICA干预组Ⅳ(1 mmol/L Mn2++10 μmol/L ICA)、ICA干预组Ⅴ(1 mmol/L Mn2++50 μmol/L ICA)。
TM3细胞接种于96孔细胞培养板中,密度为1×104个/孔。24 h后更换培养基,在对照组加入10 μl生理盐水与0.1μl DMSO,模型组加入10 μl MnCl2稀释液B与0.1μl DMSO,ICA干预组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ分别加入 0.1 μl ICA溶液E、D、C、B、A与10 μl MnCl2稀释液B作用24 h,每孔加入10 μl MTT,于37 ℃细胞培养箱中孵育4 h,弃培养基,每孔加入100 μl DMSO。用酶标仪测定570 nm处的吸光度(OD570),计算细胞存活率(细胞存活率=实验组OD570/对照组OD570×100%)。
2.1 ICA对锰暴露SD大鼠体重的影响 SD大鼠体重检测结果显示,与对照组相比,模型组与ICA干预组SD大鼠的体重差异均不显著(图1);提示锰暴露与ICA治疗对SD大鼠体重均无明显影响。
2.2 ICA对锰暴露SD大鼠睾丸形态的影响 HE染色结果显示,对照组睾丸生精小管的生精上皮结构完整,生精细胞数量较多;与对照组相比,模型组睾丸生精小管的生精上皮结构不完整,各级生精细胞数量较少;与模型组相比,ICA干预组睾丸的生精细胞数量较多(图2)。以上结果提示,锰可诱导SD大鼠睾丸损伤,ICA对锰诱导的睾丸损伤具有修复作用。
A-C分别为对照组、模型组、ICA干预组SD大鼠睾丸HE染色结果,×100;D-F分别为对照组、模型组、ICA干预组SD大鼠睾丸HE染色结果,×200。
2.3 ICA对锰暴露大鼠血清睾酮的影响 精子发生依赖高浓度的睾酮环境,为探究ICA对锰暴露大鼠血清睾酮含量的影响,我们检测了SD大鼠血清睾酮的含量。结果显示,与对照组相比,模型组SD大鼠血清睾酮浓度显著降低(P<0.05);与模型组相比,ICA干预组SD大鼠血清睾酮浓度显著升高(P<0.05)且接近对照组水平(图3)。上述结果提示,锰可显著降低SD大鼠血清睾酮浓度,ICA可逆转锰诱导的大鼠血清睾酮浓度下降。
#:与对照组比较,P<0.05;*:与模型组比较,
2.4 ICA对锰暴露大鼠睾丸组织睾酮生成相关基因的影响 睾酮的合成需要StAR的转运与P450scc、3β-HSD的催化(图4)。为探究ICA对锰暴露大鼠血清睾酮浓度影响的机制,检测了大鼠睾丸组织中睾酮生成相关基因StAR、P450scc、3β-HSD的表达情况,qPCR结果显示,与对照组相比,模型组StAR和P450scc相对表达量显著降低(P<0.05);与模型组相比,ICA干预组StAR和P450scc相对表达量显著升高(P<0.05),但并未恢复至对照组水平;与StAR和P450scc相似,锰可抑制3β-HSD的表达(P<0.05);ICA可促进锰暴露大鼠3β-HSD的表达(P<0.05),但高于正常水平(图4)。
#:与对照组比较,P<0.05;*:与模型组比较,
2.5 ICA对锰暴露睾丸间质细胞TM3活力的影响 睾丸中不仅有睾丸间质细胞,还有各级生精细胞和支持细胞等,由于睾酮在睾丸间质细胞中产生,为进一步探究ICA对锰暴露睾丸间质细胞活力的影响,在体外培养小鼠睾丸间质细胞TM3,采用MTT法检测ICA对锰暴露TM3细胞活力的影响。结果显示,与对照组相比,模型组TM3生存率显著降低(P<0.05);与模型组相比,ICA干预组Ⅲ和ICA干预组Ⅳ的TM3生存率显著升高(P<0.05,图5)。以上结果提示,锰可抑制TM3的体外增殖,ICA可促进锰暴露TM3的体外增殖。
#:与对照组比较,P<0.05;*:与模型组比较,
随着全球出生人口的不断下降,不孕不育已经逐渐成为危害人类的疾病,2022年我国首次出现自1961年以来人口负增长现象,预计到2030年我国不孕不育率将达到20%[14-15],男性不育约占50%[9]。引起不孕不育的原因有辐射、香烟、重金属污染等,其中重金属污染为主要原因之一。我省富含锰矿[16],流行病学调查研究表明,锰矿工人的精液中锰含量显著高于正常水平[17],其生殖能力显著降低,其妻子流产率、死胎率显著升高[18]。由于长期暴露于富含锰的环境之中,导致锰在人体存在累积效应,锰矿工人生殖健康受到越来越大的威胁。精子发生受雄性激素调控[9],而锰可影响雄性激素的合成与分泌[12]。ICA可提高睾酮水平[13],探讨ICA能否提高锰暴露SD大鼠睾酮水平及其作用机制对治疗锰引起的生殖损伤具有重要意义。
精子发生依赖于高浓度的睾酮环境[9],睾酮由胆固醇进入线粒体内膜经过一系列酶促反应生成,胆固醇从线粒体外膜到内膜的跨膜转运是睾酮产生的关键步骤,受类固醇急性调控蛋白 (Steroid acute regulatory protein,StAR)的调节,细胞色素P450侧链裂解酶(Cytochrome P450 side chain cleavage,P450scc)是唯一将胆固醇转化为孕烯醇酮的酶,孕烯醇酮经3β-羟基类固醇脱氢酶 (3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)等酶催化,最终生成睾酮[13]。
有研究表明,噻虫嗪通过3β-HSD抑制睾酮合成[19],超负荷运动通过P450scc抑制睾酮合成[20]。本实验结果显示,锰可诱导SD大鼠睾丸损伤,与熊可艺等[21]的研究结论基本一致;ICA对锰诱导的睾丸损伤具有修复作用。锰可抑制大鼠睾丸组织中StAR、P450scc和3β-HSD的表达,其睾酮水平也随之下降;ICA可促进锰暴露大鼠睾丸组织中StAR、P450scc和3β-HSD的表达,睾酮水平也随之升高。虽然ICA干预组中3β-HSD表达高于对照组,但受限于胆固醇的转运和孕烯醇酮的含量,其睾酮水平仍低于对照组。锰可能是通过抑制胆固醇向线粒体内膜转运、抑制胆固醇的4’-甲基戊基的剪切(孕烯醇酮的生成)和抑制孕烯醇酮羟基的氧化与Π键的转位(孕烯醇酮向睾酮转化),从而抑制睾酮的生成,ICA可促进睾酮的生成。
综上,锰可抑制StAR、P450scc和3β-HSD表达,抑制睾丸间质细胞合成睾酮,ICA可促进StAR、P450scc和3β-HSD表达,促进锰暴露睾丸间质细胞合成睾酮;锰可抑制睾丸间质细胞TM3的体外增殖,ICA可促进锰暴露TM3的体外增殖,但其具体作用机制尚不明确,锰与ICA在体内如何调控StAR、P450scc和3β-HSD基因表达也尚不清楚,需进一步研究。
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