董贤凤,郑明辉
(遵义医科大学 寄生虫学教研室,贵州 遵义 563006)
冈田绕眼果蝇(Phorticaokadai,P.okadai)为斯果蝇亚科(drosophilidae)Phortica属,是我国结膜吸吮线虫的主要传播媒介及中间宿主。结膜吸吮线虫病是一种人兽共患病[1],感染者主要表现为眼部瘙痒、异物感、结膜充血或分泌物增多等症状,我国已有28个省、直辖市报道过人结膜吸吮线虫病例,随着流行趋势的增加,人们对结膜吸吮线虫的防治越来越重视[2]。此外,冈田绕眼果蝇还是一种农业害虫,主要危害蔷薇科水果,包括梨子、苹果和桃子等[3]。冈田绕眼果蝇发育周期短[4],雌虫将卵产在梨等蔷薇科水果果皮内,孵化的幼虫直接取食果肉,造成农业经济的损失。目前,化学防治仍是控制冈田绕眼果蝇的主要手段,但因冈田绕眼果蝇幼虫直接钻蛀到果实内部,化学防控难以达到防治效果,且长期使用化学杀虫剂不仅会导致害虫产生耐药性,还会产生农药残留对环境造成污染。鉴于此,开发绿色、高效的防治策略成为研究热点。
目前常用的诱捕剂有苹果醋、糖醋液等[5-6],但成熟期内的寄主果实比糖醋液等诱捕剂对果蝇更有吸引力。鉴于此,以昆虫的寄主挥发物为靶点,开发具有针对性的化学杀虫剂可以极大地提高害虫的防治效率。寄主植物挥发物是植物本身合成和释放出来的次级代谢产物,是影响昆虫觅食、寻找产卵场所以及躲避天敌等行为活动的重要物质[7]。刘柳等[8]成功从苹果挥发物中筛选出了对桃小食心虫(carposinaniponensis)具有引诱效应的化合物。此外,本课题组2015年在贵州省遵义市郊区梨园捕获冈田绕眼果蝇,随后在遵义医科大学寄生虫实验室进行长期饲养,发现其摄食、产卵更趋向于发酵3 d后的梨(皇冠梨),并观察冈田绕眼果蝇确实存在“绕眼飞行”和“袭眼行为”,但何种挥发物组分引起这些特性还不明确。因此,本研究在课题组前期利用GC-MS技术对未发酵梨和发酵3 d梨的挥发物进行收集分析,获得了14种特异性存在的挥发物组分,根据冈田绕眼果蝇具有“绕眼行为”、“喜食寄主眼部分泌物”等特点查阅文献得到4种跟人体有关的昆虫信息化合物[9-11](具体挥发物种类见表1),共18种待测挥发物进行试验,观察这些挥发物对冈田绕眼果蝇的嗅觉行为反应,以期为开发针对冈田绕眼果蝇的高效引诱剂提供理论基础。
表1 挥发物组分及来源
1.1 虫源 本研究所用冈田绕眼果蝇于2015年在遵义市郊区捕获,并在遵义医科大学寄生虫学教研室实验室饲养和繁育。饲养条件为:室内温湿度分别为(75±5)%和(28±2)℃,光照8 h/d。实验采用的是羽化3 d的冈田绕眼果蝇。
1.2 挥发物溶媒筛选 图1是冈田绕眼果蝇嗅觉引诱装置。利用Y型管引诱装置筛选候选挥发物的溶媒,试验前将所需仪器在流水下洗净后,75%酒精浸泡2 h,烘干备用。Y型管的两侧臂长均为7 cm,内径2 cm,臂夹角为60°,两臂端部利用橡胶塞和1 mL枪头相连接。试验时Y型管的一侧味源臂放置滴有40 μL无菌水的滤纸条,另一侧味源臂放置滴加等量的0.1%甲醇滤纸条,随后放置于恒温培养箱中观察12 h,记录捕获果蝇数。每20只成虫为一组,重复5次。
A:四臂嗅觉仪;B:Y型管。
1.3 单一挥发物标准品对果蝇的行为反应测定 利用自制四臂管对冈田绕眼果蝇的行为反应进行测定。昆虫对不同信息化合物及其浓度具有不同的行为反应,因此本研究用溶媒将液体标准品稀释成高、中、低3个浓度(低浓度0.01%,中浓度0.1%,高浓度1%),固体试剂配制成0.1、1、10 μg/mL[12-13],分别观察溶媒组及不同浓度组对冈田绕眼果蝇的引诱效果。选择羽化3 d的成虫作为实验用虫,先将50只实验用虫放置在“四臂”管中间活动区域,再将滴有40 μL高、中、低3个浓度标准品及溶媒(0.1%甲醇)的平底玻璃管(管底垫有1 cm×1 cm无菌滤纸)用橡胶塞和1 mL枪头连接到“四臂”管(如图1:中央活动区域50 mL,顶部开有0.5 cm透气孔,四臂均为5.5 cm、口径2.4 cm)的4个臂上。连接玻璃管时,高、中浓度组放置于相对位置,低浓度组与对照组放置于相对位置,随后置于27 ℃孵育箱中观察12 h,实验结束记录引诱果蝇数,测试时间为早上9∶00到21∶00,每组重复5次。
1.4 统计学分析 利用IBM SPSS Statistics 29.0软件对数据进行处理,利用单因素方差(ANOVA)比较同一性别中溶媒组与不同浓度挥发物组之间的引诱效果,P<0.05表示差异具有统计学意义,分析数据由Graphpad prism 8.3软件作图。
2.1 溶剂筛选 由于甲醇溶解性和挥发性好,可以溶解许多有机物和无机物。因此,若甲醇对冈田绕眼果蝇的行为反应无影响,则可用于本研究中待测挥发物的溶剂使用。在挥发物溶媒筛选试验中,发现0.1%甲醇与无菌水对冈田绕眼果蝇的引诱效果并无明显差异(P>0.05,图2),可作为挥发物溶剂使用。
2.2 单一挥发物标准品对果蝇的行为反应测定 18个标准品对冈田绕眼果蝇进行行为反应的测定结果如图3,对雌成虫具有引诱作用的挥发物有8种,包括1%2,3-丁二酮、1%苯乙醇、1%丙酸乙酯、0.01%辛酸乙酯、0.01%和1%乙酸乙酯、0.01%乙酸异戊酯、0.01%和1%月桂酸乙酯、0.01%正癸酸;对雄成虫具有引诱作用的挥发物同样有8种,包括0.01%和1%2,3-丁二酮、0.01%和1%2,4-癸二酸-1-醇、0.1%苯乙醇、0.01%和0.1%丙酸乙酯、0.01%辛酸乙酯、0.1%乙酸乙酯、0.01%和1%月桂酸乙酯、1%正癸酸;而芳樟醇对雌、雄成虫均有趋避作用。具有引诱作用的挥发物中,除乙酸异戊酯只对雌成虫具有引诱作用、2,4-癸二酸-1-醇只对雄成虫具有引诱作用外,其余7种挥发物对雌、雄成虫均有引诱作用。
A :1-辛烯-3-醇;B: 2,3-丁二酮;C :2,4-癸二酸-1-醇;D: 6-甲基-5-庚烯-2-酮;E:苯甲酸乙酯;F:苯乙醇;G:丙酸乙酯;H:芳樟醇;I:辛酸;J:辛酸乙酯;K:乙酸乙酯;L:乙酸异戊酯;M:异辛醇;N:吲哚;O:月桂酸乙酯;P:正癸酸;Q:正壬醇;R:正辛醇;与0.1%甲醇比较, P<0.05, P<0.01。
寄主挥发物可作为研发具有针对性且高效的引诱剂靶点。现有研究已经从果蝇寄主鉴定出了一些具有引诱效应的挥发物组分,如3-甲基丁酸丁酯、乙酸、己酸等能吸引果蝇取食或产卵[14-15],但多集中于黑腹果蝇[16],关于寄主挥发物对冈田绕眼果蝇引诱效果的研究鲜有报道,本研究选取18种寄主挥发物对冈田绕眼果蝇进行嗅觉行为反应测定。昆虫对不同信息化合物及其浓度具有不同的行为反应,因此本研究设置了高、中、低3个浓度,在测试结果中,如果有1种或者多种浓度的挥发物对果蝇有吸引或排斥作用,则认为该挥发物能够调控果蝇的行为反应。若低浓度具有引诱效果而高浓度存在趋避作用,则认为是浓度过高导致。
测试结果发现,对冈田绕眼果蝇雌、雄成虫均有引诱作用的挥发物有7种,分别是2,3-丁二酮、苯乙醇、丙酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸乙酯、月桂酸乙酯和正癸酸,而乙酸异戊酯只对雌成虫具有引诱作用,2,4-癸二酸-1-醇只对雄成虫具有引诱作用。另外发现芳樟醇对雌、雄成虫均有趋避效果。已有研究发现一定浓度的乙酸乙酯对黑腹果蝇有引诱作用[14,17],月桂酸乙酯对枣实蝇具有引诱效果[18],而苯乙醇及乙酸异戊酯对桔小实蝇有引诱效果[19-20]。上述研究结果与本研究存在相同部分,并发现了冈田绕眼果蝇特有的引诱挥发物。但昆虫对寄主挥发物和性信息素的识别是一个极其复杂的过程,跟挥发物的种类、特定比例及浓度有关,而挥发物的浓度过高可能会导致趋避效应。鉴于此,芳樟醇对冈田绕眼果蝇的趋避作用可能是浓度过高导致,而其他挥发物效果不明显可能是选择的浓度范围较小,还没有达到趋避效果。
寄主挥发物对于在昆虫的寄主选择有着不可或缺的作用,这为冈田绕眼果蝇的防治提供了新的研究方向。根据研究结果,可以利用2,3-丁二酮、丙酸乙酯、辛酸乙酯和正癸酸作为引诱源,开发对冈田绕眼果蝇具有针对性的诱捕剂,能在一定程度上控制冈田绕眼果蝇的危害,阻断结膜吸吮线虫的传播,也不会干扰其他昆虫。但在复杂的外界环境中,各种挥发物都不是单独存在的,昆虫通过识别寄主挥发物的特定组分或组分间的特定比例对寄主进行识别,以此产生特定的行为反应[21]。本试验只进行了单一挥发物对冈田绕眼果蝇的嗅觉行为反应测试,不同比例挥发物混合液的引诱效应如何不得而知,后续将进一步对具有引诱效果的挥发物按照特定比例进行混配,筛选出不同挥发物间的最佳配比。通过对冈田绕眼果蝇的行为反应测定,初步筛选出对冈田绕眼果蝇具有引诱或趋避效果的单一挥发物,为开发新型的昆虫防治措施提供理论基础。同时,这些对冈田绕眼果蝇具有引诱效应的信息化合物需要进行室外实验以进一步验证其在冈田绕眼果蝇防治中的应用价值。
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