张静，李静，侯红丽，朱宏瑞
作者单位：1开封市儿童医院，a中医科，b感染科，河南 开封 475000；
2郑州儿童医院、河南省儿童医院、郑州大学附属儿童医院新生儿科，河南 郑州450053
呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是常见导致下呼吸道感染的单链RNA 病毒之一，会导致病人出现咳嗽、哮喘和呼吸困难等症状，严重危害病人生理健康［1］。RSV 肺炎常见于婴幼儿或老年人等免疫力低下的人群，可通过空气飞沫和密切接触传播［2］。高危人群可在流行季节使用RSV免疫球蛋白进行预防，临床治疗中常使用利巴韦林、干扰素等药物进行治疗，但因耐药性强与毒副作用大面临着治疗困难，亟需寻找安全有效的替代药物［3］。近年来随着对RSV肺炎病程发展的深入研究，一些传统中医药在临床治疗中取得良好效用。黄芩苷是提取自唇科植物黄芩干燥根的主要活性成分，具有清热润肺、泻火解毒和止血安胎等多种药效，常用于治疗湿温暑热、胸闷恶心和肺热咳嗽等病症［4-5］。研究报道，黄芩苷可以有效治疗肺炎，但其作用机制尚不明确［6］。因此，本研究2022 年3月至2023 年7 月建立RSV 肺炎幼鼠模型，探讨黄芩苷对RSV 肺炎幼鼠肺损伤的修复作用及其可能作用机制，为黄芩苷药物开发及RSV 肺炎的临床治疗提供参考依据。
1.1 材料
1.1.1实验动物 55 只4 周龄SPF 级雄性SD 大鼠购自杭州子源实验动物科技有限公司，体质量60～70 g，动物生产合格证号：SCXK（浙）2019-0004。所有大鼠于相同饲养环境适应性饲养7 d，提供标准饲料和清洁水源，定期更换垫料，保持良好通风。环境条件设置为：温度20～24 ℃，湿度（50±10）%。研究过程中对动物的处置符合动物委员会的准则。
1.1.2药品、主要试剂和仪器 黄芩苷（纯度：HPLC≥98%，成都曼思特生物科技有限公司，货号A0016）；
RSV-long 病毒株（中国预防医学科学院病毒所，半数组织培养感染量TCID50为10-3）；
兔抗β-actin 多克隆抗体、p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）和磷酸化p38 丝裂原活化蛋白激酶（p-p38MAPK）多克隆抗体、山羊抗兔二抗IgG（北京索莱宝科技有限公司）。BIOFUGE28RS型低温高速离心机（德国HERAEUS 公司）；
7500 型荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。
1.2 方法
1.2.1模型建立与分组给药 适应性饲养7 d 后，选取45 只幼鼠采用鼻腔接种RSV 病毒株法建立RSV 肺炎模型［7］。将幼鼠使用乙醚进行轻度麻醉，左右鼻腔交替滴入RSV 病毒液50 μL 建立模型，另选取10只幼鼠作为对照组，对照组滴入等量生理盐水，每日接种1 次，连续3 d。大鼠出现行动迟缓、呼吸急促且体温升高，随机抽取5 只大鼠制作肺部组织病理切片，观察肺部病理变化，出现肺泡病变、各支气管上皮炎症细胞浸润，肺泡间隔变大等现象视为造模成功。造模成功幼鼠随机分为模型组、黄芩苷低、中和高剂量组，各10 只，另设对照组（10 只）。参照文献［8-9］，黄芩苷低、中和高剂量组大鼠分别灌胃25、50和100 mg/kg黄芩苷，1次/天，连续7 d。
1.2.2标本采集 给药结束1 d 后，称取各组幼鼠体质量，麻醉，固定于手术台上，结扎右侧肺叶，注入1 mL PBS 溶液并来回抽吸灌洗支气管肺泡，注入5次后回收肺泡灌洗液，离心取上清液，-20 ℃保存。摘眼球采集血液，离心，分离血清，-20 ℃保存。处死大鼠，快速取出肺组织，称重，将左肺分成两部分，一部分浸入4%多聚甲醛液固定，用于HE 染色，一部分用于称取湿干重量。右肺置于-80 ℃保存备用。
1.2.3肺指数与肺组织湿/干比测定 计算各组幼鼠肺指数，肺指数=（肺质量/体质量）×100%。将未用4%多聚甲醛固定的左肺组织在80℃恒温烤箱烘烤至恒重，记为干重，计算肺组织湿/干比（W/D）。肺组织W/D=肺组织湿重/肺组织干重。
1.2.4炎症因子水平检测 采用双抗体夹心法检测肺泡灌洗液肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）水平，严格按照试剂盒说明书进行操作，酶标测定仪于450 nm 波长处检测各孔吸光度值，根据标准曲线计算样品浓度。
1.2.5T 细胞亚群检测 取出幼鼠外周血，加入单克隆抗体CD3+、CD4+和CD8+各5 μL，混匀后室温下静置30 min，加入红细胞裂解液300 μL，反应30 min充分裂解，使用流式细胞分析仪检测各组幼鼠外周血中T细胞亚群的变化。
1.2.6肺组织HE 染色观察 取出固定后的左侧肺组织，脱水、包埋、切片，进行HE 染色。光学显微镜下观察肺组织病理学变化，随机选取3 个清晰视野拍照。
1.2.7RT-PCR 检测mRNA 表达 取-80 ℃保存的右肺组织100 mg 尽量剪碎放入EP 管中，加入1 mL TRIZOL 试剂提取总RNA。反转录试剂盒合成cDNA，配制PCR 反应体系20 μL：TB GreenPremix Ex TapⅡ（2×） 10 μL，正、反向引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，RNase free ddH2O 6.4 μL。反应条件为95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 35 s 循环40 次。引物设计为p38MAPK：正向-5′ ATGCCGAAGATGAACTTTGC 3′、反向-5′ CCCTGCTTTCAAAGGACTGA 3′；
β-actin：正向-5′ GGCTGTATTCCCCTCCATCG 3′、反向-5′ CCAGTTGGTAACAATGCCATGT 3′。采用2-ΔΔCt法以目的基因相对内参表达量进行比较分析。
1.2.8蛋白质印迹法检测蛋白表达 取剩余-80 ℃保存的右肺组织加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA 细胞裂解液，冰上裂解30 min，匀浆提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取40 μL 蛋白样品进行电泳，湿转，5%脱脂牛奶封闭，加入1∶1 000 相应稀释一抗，4 ℃下摇床封闭，洗膜，再加入1∶3 000 相应稀释二抗，室温摇床封闭60 min，洗膜。加入ECL显影液进行曝光，保存图像，以β-actin 为内参，观察条带上相应的蛋白表达量并对目的条带光密度值进行计算分析。
1.3 统计学方法SPSS 23.0统计学软件分析数据，计量数据符合正态分布以±s表示，采用单因素方差分析进行多组间比较，LSD-t检验进行两组间比较。校验水准α=0.05。
2.1 体质量和肺指数比较与对照组比较，模型组幼鼠体质量降低，肺指数升高（P＜0.05）。与模型组比较，黄芩苷低、中和高剂量组幼鼠体质量升高，肺指数降低，且各指标具有剂量依赖性（P＜0.05）。见表1。
表1 各组幼鼠体质量和肺指数比较/± s
表1 各组幼鼠体质量和肺指数比较/± s
注：①与对照组比，P＜0.05。②与模型组比，P＜0.05。③与黄芩苷低剂量组比，P＜0.05。④与黄芩苷中剂量组比，P＜0.05。
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2.2 肺组织W/D 比较与对照组比较，模型组幼鼠肺组织W/D（7.82±0.37）显著高于对照组（3.74±0.37），差异有统计学意义（P＜0.05）。黄芩苷低、中和高剂量组幼鼠肺组织W/D（6.13±0.40、5.62±0.41、4.03±0.30）均显著低于模型组（7.82±0.37），且呈剂量依赖性（P＜0.05）。
2.3 炎症因子水平比较与对照组比较，模型组幼鼠肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平升高（P＜0.05）。与模型组比较，黄芩苷低、中和高剂量组幼鼠TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平降低，且各指标具有剂量依赖性（P＜0.05）。见表2。
表2 各组幼鼠炎症因子水平比较/（ng/L，± s）
表2 各组幼鼠炎症因子水平比较/（ng/L，± s）
注：TNF-α为肿瘤坏死因子-α，IL-1β为白细胞介素-1β，IL-6为白细胞介素-6。①与对照组比，P＜0.05。②与模型组比，P＜0.05。③与黄芩苷低剂量组比，P＜0.05。④与黄芩苷中剂量组比，P＜0.05。
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2.4 T 淋巴细胞亚群水平比较与对照组比较，模型组幼鼠外周血中CD3+水平降低，CD4+和CD4+/CD8+水平升高（P＜0.05）。与模型组比较，黄芩苷低、中和高剂量组幼鼠CD3+水平升高，CD4+和CD4+/CD8+水平降低，且各指标具有剂量依赖性（P＜0.05）。见表3。
表3 各组幼鼠T淋巴细胞亚群水平比较/± s
表3 各组幼鼠T淋巴细胞亚群水平比较/± s
注：①与对照组比，P＜0.05。②与模型组比，P＜0.05。③与黄芩苷低剂量组比，P＜0.05。④与黄芩苷中剂量组比，P＜0.05。
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2.5 肺组织HE 染色比较结果显示，对照组幼鼠肺组织结构完整，形态正常，未见炎症细胞浸润、水肿等现象。模型组幼鼠肺泡间隔明显增宽，肺泡壁明显增厚，部分肺泡可见出血、间质水肿现象，存在大量炎症细胞浸润现象。黄芩苷低、中和高剂量组幼鼠肺组织结构受损现象得到改善。见图1。
图1 各组幼鼠肺组织病理学变化（HE染色×200)：A为对照组；
B为模型组；
C为黄芩苷低剂量组；
D为黄芩苷中剂量组；
E为黄芩苷高剂量组
2.6 p38MAPK mRNA 水平比较模型组幼鼠肺组织p38MAPK mRNA 表达水平（1.28±0.11）显著高于对照组（0.32±0.03）（P＜0.05）。黄芩苷低、中和高剂量组幼鼠肺组织p38MAPK mRNA 表达水平（0.97±0.10、0.73±0.06、0.55±0.04）显著低于模型组（1.28±0.11），且呈剂量依赖性（P＜0.05）。
2.7 p38MAPK 蛋白水平比较与对照组比较，模型组幼鼠肺组织p-p38MAPK蛋白表达水平升高（P＜0.05）。与模型组比，黄芩苷低、中和高剂量组幼鼠肺组织p-p38MAPK 蛋白表达水平降低，且各指标具有剂量依赖性（P＜0.05）。见表4；
图2。
图2 幼鼠肺组织p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）蛋白检测
表4 各组幼鼠p38MAPK蛋白水平比较/± s
表4 各组幼鼠p38MAPK蛋白水平比较/± s
注：p38MAPK 为p38 丝裂原活化蛋白激酶，p-p38MAPK 为磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶。①与对照组比，P＜0.05。②与模型组比，P＜0.05。③与黄芩苷低剂量组比，P＜0.05。④与黄芩苷中剂量组比，P＜0.05。
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RSV 致病机制复杂，主要与病原体毒作用、固有免疫和适应性免疫等综合作用相关［10］。RSV 感染后，通过诱发肺组织炎症导致肺组织Th1/Th2 失衡，破坏免疫系统。此时肺组织的炎症反应失控，导致肺组织受损，促使蛋白质等大分子物质进入支气管与肺泡内，诱发肺水肿，降低肺功能，严重时可引发呼吸衰竭［11］。炎症在中医上属“热”，外邪入体引发内热，常见红肿、热痛等症状，中医学中未见“肺炎”病名，属“肺热病”范围。病位在于肺部，病因为风温外侵，病理为痰、热、淤、毒阻塞于肺，导致肺功能失常。中药在治疗炎症时多以清热解毒和行气活血为主［12］。黄芩首次记录于《神农本草经》，为唇形科植物黄芩的干燥根，含有多种活性物质［13］。黄芩苷作为其主要药效物质，多项研究表明，黄芩苷可以调节机体免疫力和抗炎等功效［14］。本研究探讨黄芩苷对RSV 肺炎幼鼠肺脏损伤的修复作用。
在本研究结果显示，模型组幼鼠体质量明显降低，而肺指数和肺组织W/D 均显著升高。检测炎症因子水平也发现，模型组幼鼠炎症因子水平（TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平）均升高。肺指数与肺组织W/D 比值是判断肺功能的主要指标，当肺组织受到病毒感染，由于异常升高的炎症反应致使肺组织水肿，因而肺质量明显升高。提示RSV 肺炎模型建立成功且模型组幼鼠肺组织受到严重损伤，幼鼠体内伴有严重的炎症反应。在给予了不同剂量黄芩苷治疗后各组幼鼠均表现肺指数、肺组织W/D 和炎症因子水平均呈下降趋势，幼鼠体质量随之恢复正常，且表现出浓度依赖性，以黄芩苷高剂量组效果最佳。提示幼鼠肺组织损伤在黄芩苷的治疗下得到修复，体内的炎症反应也明显减轻。此外，黄芩苷治疗后幼鼠肺组织病理损伤程度减轻，进一步证实黄芩苷对RSV肺炎幼鼠肺组织损伤的修复作用。
炎症反应是影响肺炎病情进展的重要机制之一，而外周血T 淋巴细胞亚群作为机体免疫的重要检测指标，可直观反映机体免疫情况［15］。在肺炎进程中，MAPK 家族信号通路一直发挥着重要作用，是一类丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶类信号通路，在一定量的炎症因子、神经递质等刺激条件下会激活，p38MAPK 是主要参与并控制这炎症反应的典型通路之一［16］。在本研究中，模型组幼鼠肺组织p38MAPK 基因水平与p-p38MAPK 蛋白水平均高度表达，结合幼鼠外周血中CD3+水平降低，CD4+和CD4+/CD8+比值升高。提示模型组幼鼠在RSV 的感染刺激下，体内p38MAPK 信号通路被激活，炎症细胞合成并释放出大量的炎症因子，促使炎症因子高度表达，免疫系统平衡失调。CD3+T 淋巴细胞是成熟T 细胞的表面标志，通过适当多种细胞因子辅助B 细胞和效应T 细胞活化，促进细胞免疫，从而调节免疫功能［17］。CD4+/CD8+比值的相对平衡对未知机体免疫稳定起着重要作用，是反映机体免疫功能的重要标志之一。在本研究中，黄芩苷各剂量组幼鼠肺组织中p38MAPK 基因水平与p-p38MAPK 蛋白表达水平均明显降低，且外周血中CD3+水平升高，CD4+和CD4+/CD8+比值降低。提示黄芩苷通过影响p38MAPK 表达，降低炎症因子水平，调节T 淋巴细胞亚群比例，改善免疫细胞失衡，控制与延缓RSV肺炎的发展过程，对RSV 肺炎幼鼠肺损伤有积极影响。
综上所述，黄芩苷能够降低RSV 肺炎幼鼠炎症因子水平，调节T 淋巴细胞亚群比例，减轻肺损伤，可能是通过影响p38MAPK信号通路发挥作用，为临床治疗RSV肺炎提供实验依据。
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