李 爽,付玉莹,佟慧丽,李树峰,严云勤*
(1.东北农业大学 生命科学学院 细胞与发育生物学实验室,黑龙江 哈尔滨 150030;2.黑龙江省动物细胞与基因工程重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150030)
肌肉卫星细胞 (muscle derived satellite cells,MDSCs)是一种存在于成熟肌肉组织中的肌肉细胞的前体干细胞。正常条件下MDSCs保持静息状态,当肌肉受到损伤或刺激时,存在于基底膜的MDSCs被激活并开始增殖,或退出细胞周期、迁移并相互融合形成新的肌纤维,这个过程被称为细胞分化[1-2],受许多因素和信号通路的调控。MyoG是转录因子家族的成员,在骨骼肌卫星细胞的分化时表达[3]。MHC为肌肉结构蛋白,它们是检测骨骼肌卫星细胞分化的标志分子[4]。
葡萄糖调节蛋白 94 (glucose-regulated protein 94,GRP94),也称为 gp96 或热休克蛋白 90 kDa β成员1( heat-shock protein 90 β1,HSP90b1),是分子伴侣家族的成员,主要存在于内质网中[5]。研究表明,GRP94对于肌肉发育至关重要,GRP94基因敲除小鼠胚胎干细胞不能分化为肌肉组织,GRP94表达水平的降低会抑制C2C12细胞的分化。相反,GRP94 的过表达可以加速肌管的形成[6-7]。前期研究工作表明,GRP94促进小鼠C2C12细胞分化[8]。但是GRP94对牛MDSCs分化的影响及其作用的分子机制尚不清楚。
PI3K信号介导多种关键的生物学过程,如葡萄糖稳态、蛋白质合成、细胞增殖和存活[9]。PI3K的激活可以通过第二信使磷脂酰肌醇三磷酸(phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate,PIP3)向AKT传递信号,通过磷酸化激活AKT。
AKT进一步激活mTOR,调节细胞生命活动,如细胞生长、增殖和迁移等[10-13]。此外,PI3K/AKT/mTOR 抑制分化并促进 C2C12 的增殖[8]。但是,PI3K/AKT/mTOR信号通路与牛MDSCs分化的关系尚不明确。
本研究旨在探讨GRP94对牛MDSCs分化的影响,阐明GRP94调节牛MDSCs分化的分子机制,挖掘调控牛MDSCs分化的功能基因,从而为牛肌肉品种改良和育种提供有利支撑。
1.1 试验材料细胞培养相关试剂购自Gibco公司与Sigma公司;Anti-GRP94(bs-0147R)、Anti-Desmin (bs-1026R)、Anti-PI3K (bs-2067R)、Anti-phospho-PI3K (bs-5570R)、Anti-AKT1+2+3 (bs-6951R)、Anti-phospho-AKT1+AKT2+AKT3 antibody (bs-5193R)、Anti-mTOR (bs-1992R)、Anti-Phospho-mTOR antibody (bs-5329R)、Goat Anti-Rabbit IgG H&L(bs-0295G)、Goat Anti-Rabbit IgG H&L/FITC (bs-0295G-FITC) 购自博奥森公司;PI3K抑制剂(LY294002)、mTOR抑制剂(Rapamycin)购自Selleck公司;T4连接酶、BbsⅠ酶购自NEB公司;pSPgRNA、SP-dCas9、SP-dCas9-VPR购自Addgene公司。
A.牛MDSCs未分化与不同分化不同阶段(1,3,5 d)的免疫荧光染色结果(×100)(绿色荧光为GRP94蛋白,蓝色为DAPI染色的细胞核);B～E.未分化与分化不同天数的牛MDSCs中GRP94、MyoG和MHC的蛋白表达。**.P<0.01;ns.P>0.05。下同
1.2 试验动物及细胞培养本试验用新生胎牛肌肉经黑龙江省东北农业大学动物保护委员会审查批准后获取。取新生胎牛胫骨前肌(n=3),剪碎后加入0.1% 胶原酶Ⅰ,37℃水浴摇床孵育2 h,离心后PBS清洗沉淀物,接下来利用含0.25% EDTA的胰蛋白酶消化30 min,过400目铜网,离心去上清,向沉淀物中加入培养液,获得原代牛MDSCs。
上述分离获得的牛MDSCs培养在含10%FBS、含100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的高葡萄糖培养基中。每2 d更换1次培养基,当细胞汇合度达到50%～60%后利用含有0.1%EDTA的胰蛋白酶消化细胞,将细胞均匀接种至6孔板中。培养24 h后,细胞密度达到70%,可用于细胞分化或细胞转染。用含2%马血清的高糖培养基对细胞进行诱导分化,根据试验需要分化培养不同的时间。
1.3 试验方法
1.3.1GRP94基因sgRNA载体的构建 用 TRIzol 试剂从细胞中提取总RNA,针对牛 GRP94(NCBI 基因 ID:282646)启动子序列(从-899～+1)设计sgRNA序列,在sgRNAs前面加上“CACC”,作为BbsⅠ酶切位点保护碱基,具体序列如表1。由上海生工合成后进行退火接合。将不同的sgRNA序列分别克隆到pSPgRNA载体中,并命名为 pSPgRNA-B(1～3)。
表1 针对牛GRP94基因启动子区的靶序列
1.3.2采用CRISPR技术激活或抑制GRP94的表达 将细胞传代至六孔板中,待细胞密度达到70%～80%时,利用PEI将构建好的质粒转染细胞。其中,pSPgRNA-B(1～3)分别与SP-dCas9-VPR(VPR)载体共转染细胞,利用CRISPR系统达到高效启动GRP94基因的目的,以此激活GRP94基因的表达;pSPgRNA-B(1～3)与dCas9共转染细胞,以此抑制GRP94基因的表达。转染后分化培养细胞72 h,收集样品。
1.3.3PI3K和mTOR抑制剂添加对细胞分化的检测 在牛MDSCs分化培养过程中分别加入PI3K的抑制剂LY294002(10 μmol/L)及mTOR抑制剂Rapamycin(Rapa)(500 nmol/L),对照组在培养液中加入2 μL DMSO,分化培养细胞72 h。每个平行试验重复3次。收集细胞用于后续Western blot及免疫荧光检测。
1.3.4蛋白提取及Western blot 利用PBS清洗细胞3次,加入蛋白裂解液在冰上裂解细胞20 min,收集蛋白。利用BCA试剂盒测定蛋白浓度。加入上样buffer,煮沸10 min,离心10 min,储存于-80℃冰箱中。配置浓度为5%浓缩胶和10%分离胶进行电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育等操作。最后利用ECL发光液及化学发光仪曝光,Image J软件灰度扫描分析。
1.3.5免疫荧光染色 向上述试验样品中加入冷甲醇固定20 min。利用0.5%Triton X-100的磷酸盐缓冲液(PBST)透膜处理15 min,加入含有5% BSA的PBST 37℃培养箱孵育1 h进行封闭。一抗4℃过夜。荧光标记二抗37℃孵育2～3 h。DAPI染液室温染色。用倒置荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察并拍照。
2.1 GRP94在牛MDSCs分化过程中的表达规律诱导牛MDSCs分化5 d,分别于未分化(0 d),分化1～5 d 收集蛋白样品并固定细胞。利用免疫荧光染色检测GRP94的表达,绿色荧光表示GRP94蛋白阳性信号。结果如图1A所示,随着细胞的分化,绿色荧光逐渐加深,GRP94表达显著增加。Western blot对细胞分化标志基因MyoG及MHC的表达进行检测,结果如图1B～E所示,MyoG及MHC的表达显著增加,表明细胞分化程度是逐渐增加的。同时随着细胞分化的增加,GRP94表达显著增加。综上,随着牛MDSCs分化的进行GRP94表达显著增加。
2.2 GRP94对牛MDSCs分化的影响为了明确GRP94对牛MDSCs分化的影响,本研究利用CRISPR/dCas9基因编辑系统来体外调控GRP94的表达,检测分化相关指标。
2.2.1激活GRP94对牛MDSCs分化的影响 在牛MDSCs中共同转染VPR及靶向GRP94基因启动子的sgRNA载体(pSPgRNA-B1、pSPgRNA-B2或pSPgRNA-B3),以实现GRP94表达的激活。Western blot结果表明,与对照组相比,pSPgRNA-B3处理组激活GRP94表达量的效果最显著。以此用于后续激活GRP94表达的试验研究。激活GRP94表达后诱导细胞分化至72 h,首先利用Western blot检测MyoG及MHC的表达。结果如图2C～F,GRP94表达增加后MyoG及MHC表达显著增加。此外,Desmin的免疫荧光结果及肌管融合率显示,激活GRP94表达后肌管明显增多,与对照组相比肌管融合率增加了27.65%(图2G、H)。上述结果表明,GRP94表达增加促进牛MDSCs分化。
A、B.GRP94激活表达载体的筛选;C～F.Western blot检测激活GRP94表达后MyoG和MHC蛋白表达变化;G、H.免疫荧光检测激活GRP94的表达对肌管融合的影响(×100)。绿色荧光代表Desmin染色,蓝色为DAPI染色的细胞核。下同
2.2.2抑制GRP94对牛MDSCs分化的影响 利用SP-dCas9(dCas9)载体与靶向GRP94基因启动子的sgRNA载体(pSPgRNA-B1、pSPgRNA-B2或pSPgRNA3)共同转染细胞后,诱导细胞分化至72 h,检测GRP94的表达。结果如图3A、B所示,pSPgRNA-B3处理组显著抑制GRP94的表达,以此用于后续试验。Western blot检测结果如图3C～F所示,抑制GRP94后MyoG和MHC的表达显著降低。免疫荧光Desmin染色结果显示,抑制GRP94表达后,细胞中肌管减少(图3G),肌管融合率减少了18.91%(图3H)。上述结果表明,GRP94表达减少阻碍牛MDSCs分化。
A、B.GRP94抑制表达载体的筛选;C～F.抑制GRP94表达后MyoG和MHC蛋白表达量的检测;G、H.免疫荧光检测抑制GRP94的表达对肌管融合的影响
综上,GRP94的激活或抑制能促进或阻碍牛MDSCs分化。因此,GRP94对牛MDSCs分化具有正向调控作用。
2.3 PI3K/AKT/mTOR信号通路对牛MDSCs分化的影响
2.3.1抑制PI3K对牛MDSCs分化的影响 由于PI3K信号通路对牛MDSCs分化的影响并不明确,本试验在牛MDSCs分化过程中添加PI3K抑制剂LY294002后检测细胞的肌管融合率及分化标志基因的表达。Desmin免疫荧光结果如图4,添加LY294002后肌管显著增多(图4A),与对照组相比肌管融合率增加27.32%(图4B)。Western blot检测如图4C～H所示,添加抑制剂后,p-PI3K、p-AKT及p-mTOR的表达量均减少,但MyoG和MHC的表达上调。上述结果表明,抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路活性促进牛MDSCs分化。
A、B.免疫荧光检测抑制PI3K的活性后对细胞分化的影响;C～H.LY294002对MyoG和MHC表达的影响
2.3.2抑制mTOR对牛MDSCs分化的影响 为了明确mTOR对牛MDSCs分化的影响,在牛MDSCs分化过程中持续添加mTOR的抑制剂Rapa。免疫荧光结果如图5A、B所示,添加Rapa后细胞分化显著增加,统计结果表明肌管融合率增加25.73%。Western blot结果如图5C～F所示,p-mTOR表达量减少后,MyoG和MHC的表达上调。以上结果表明抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路促进牛MDSCs分化。
A、B.免疫荧光检测抑制mTOR的活性后对细胞分化的影响;C～F.mTOR抑制剂Rapa对MyoG和MHC表达的影响
2.4 GRP94对P3K/AKT/mTOR信号通路的影响为了明确GRP94促进牛MDSCs分化的机制,在激活GRP94表达的同时检测PI3K/AKT/mTOR信号通路的活化。Western blot结果表明GRP94表达增加后,p-PI3K、p-AKT和p-mTOR的表达量下调(图6A～E);在牛MDSCs中抑制GRP94表达,p-PI3K、p-AKT及p-mTOR的表达量显著增加(6F～J)。上述结果表明,GRP94抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路活性。
A～E.激活GRP94表达对PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响;F～J.抑制GRP94表达对PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响(*表示P <0.05)
因此,GRP94可能通过负调控PI3K/AKT/mTOR信号通路促进牛MDSCs分化。
GRP94是94 kDa的葡萄糖调节蛋白,是一种广泛存在于细胞中的分子伴侣, 在内质网中含量丰富[14]。因此GRP94在内质网应激方面的研究获得了广泛关注,但是其在成肌细胞分化中的作用鲜有报道。本实验室前期研究工作表明,GRP94可以调节小鼠C2C12成肌细胞的分化,同时在小鼠肌肉损伤时表达显著上调,提示GRP94在成肌分化中具有重要作用[8]。本研究结果表明,GRP94的表达随着牛MDSCs的分化而逐渐升高,其对牛MDSCs的分化具有正向调控作用。
本试验采用CRISPR/dCas9基因编辑系统激活或抑制牛MDSCs分化过程中GRP94的表达。针对GRP94基因启动子序列特点设计并构建了3个sgRNA表达载体(pSPgRNA-B1、pSPgRNA-B2和pSPgRNA-B3),分别通过与dCas9和VPR载体共转染,实现对GRP94的干扰或激活。采用CRISPR技术对目标基因表达的调控具有高效性,已经被广泛应用于基因编辑领域[15-16]。本研究设计了多个sgRNA干扰片段,以防止脱靶效应,最终高效激活或抑制GRP94的表达,以明确功能基因GRP94在MDSCs分化中的表达。为肉牛肉质改良及育种提供理论依据。
目前,对于PI3K/AKT/mTOR信号通路的研究主要聚焦于其在癌细胞增殖过程中的作用,其可能为癌细胞药物作用的靶标。此外,亦有研究表明PI3K/AKT/mTOR信号通路在体内促进小鼠成肌分化[17]。本试验通过向牛MDSCs中添加PI3K和mTOR的抑制剂表明,抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路促进牛MDSCs分化,这与本实验室之前发表研究一致[18]。这与PI3K/AKT/mTOR能够正向调控小鼠成肌细胞分化的报道不一致。推测其可能是由于物种的差异或者是体内、体外环境的不一致所致。因此,PI3K/AKT/mTOR信号通路对于成肌分化的调节作用亟待深入挖掘。
在许多类型的癌细胞研究中表明,GRP94通过PI3K/AKT信号通路发挥作用[19-20]。但没有明确GRP94对PI3K/AKT/mTOR信号通路的作用,并且GRP94如何通过PI3K/AKT/mTOR信号通路促进牛MDSCs分化的机制并不明确。GRP94作为分子伴侣,能帮助多种受体蛋白折叠、分泌及运输。前期研究表明其可能与PIK3IP1结合并影响PIK3IP1的表达(未发表数据),而PIK3IP1作为PI3K的负调节因子,推测其通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路促进牛MDSCs分化。因此,GRP94通过负调控PI3K/AKT/mTOR信号通路促进牛MDSCs分化,其机制亟待进一步研究。该机制的明确不仅能够阐明GRP94调控牛成肌分化的新机制,也为肉牛育种及肉质改善提供新的思路。
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