林烈员 高建亭 张艳 师鑫潮 刘海隆 何欣
（1. 海南省海口市秀英区东山镇农业服务中心 海南海口 571100；
2. 河北农业大学动物医学院河北保定 071000；
3. 海南省农业科学院畜牧兽医研究所 海南海口 571100）
地胆草（Elephanltopus scaberL.）为菊科地胆草属草本植物[1]，主要分布于我国广东、浙江及福建等地，可全草入药。具有清热解毒、消肿利尿等功效，常用于感冒、急性扁桃体炎、结膜炎、水肿等疾病的治疗[2]。炎症是人和动物常见的综合性病理过程，是具有血管系统的活体组织对致炎因子产生的以防御为主的病理反应，可分为急性炎症和慢性炎症。其中急性炎症是指机体受到致炎因子刺激后短时间内表现出的反应。胸膜炎是最常见的炎症性疾病之一，许多危害生命的疾病，如结核病、肺炎等，都与胸膜炎有关[3]。角叉菜胶致大鼠胸膜炎模型是一种理想的急性炎症模型，常用于检测药物的抗炎效果[4]。对于啮齿动物而言，将角叉菜胶注入胸腔后可激活激酶，促进炎症因子释放，激活以中性粒细胞为主的炎性细胞，聚集在炎症部位。因此，借助此模型，通过测定炎性因子水平、MDA 含量等，可以研究药物的抗炎效果。
本研究采用乙醇回流法对地胆草活性物质进行提取，考察不同浓度提取物对大鼠急性胸膜炎作用效果，初步探讨其抗炎机制，为其研发和应用提供依据。
1.1 材料
1.1.1 试验动植物 健康昆明种雄性大鼠，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，体重（250 ±20.0）g，生产许可证号SCXK（京）2019-0010。将购买的大鼠适应性饲养一周，期间保持通风，试验开始前12 h 禁食不禁水。地胆草，2022 年3月采集于海南海口市东山镇。
1.1.2 药品与仪器 （1）药品 地塞米松磷酸钠注射液（5 mg/mL），山西兆益有限公司; 角叉菜胶，上海麦克林生化科技有限公司；
肝素钠注射液，天津生物化学制药有限公司；
无水乙醇，天津市汇杭化工科技有限公司；
0.9%生理盐水注射液，石药银湖制药有限公司；
吐温-80 及其他溶剂，福晨化学试剂有限公司；
大鼠一氧化氮（NO）ELISA检测试剂盒（上海一研生物科技有限公司）；
大鼠丙二醛（MDA）、前列腺素E2（PGE2）、肿瘤坏死因子（TNF-α）和白细胞介素-1β(IL-1β) ELISA 检测试剂盒（上海臻科生物科技有限公司）。
（2）仪器 提取浓缩罐，北京锦富仁豪科技发展有限公司；
RE-5205 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；
SHD-Ⅲ型循环水式多用真空泵，保定高新区阳光科教仪器厂；
TGL-16B 离心机，上海安亭科学仪器厂。
1.2 方法
1.2.1 地胆草乙醇提取物的制备 使用乙醇回流提取法对地胆草中的有效成分进行提取：称取地胆草2 600 g，加95%乙醇回流提取2 次，第一次加15 倍量乙醇提取2 h，第二次加10 倍量乙醇提取1 h；
合并初提液，减压浓缩，回收乙醇，浓缩瓶中有挂壁后取乙醇总提取物适量，其余药液浓缩至浸膏，加入热水500 mL，充分搅拌，备用。
1.2.2 动物模型建立及给药 将试验动物随机分为5 组，对照组分为阴性对照组（灌服5%吐温-80），阳性对照组（灌服0.5 mg/kg 地塞米松）；
试验组分别为低剂量组（按生药量计为7.5 g/kg）、中剂量组（按生药量计为15 g/kg）、高剂量组（按生药量计为30 g/kg）。按照1 mL/hg 每日灌胃1次，连续7 d；
末次给药30 min 后，用10%水合氯醛按照0.4 mL/hg 剂量腹腔注射对大鼠进行麻醉[5]，仰卧位固定，右侧胸腔部位剃毛，酒精擦拭消毒；
按照0.2 mL/hg 剂量[6]在右上肢下第7、第8 肋骨间向右胸膜腔内[7]，注入1%无菌角叉菜胶溶液致炎[8-9]，为避免肺脏受到损伤，该操作应在短时间内完成[10]。
1.2.3 取样及测定 致炎4 h 后麻醉大鼠，眶窦采血并处死；
将全血于5 000 r/min 条件下离心5 min，取上清液按试剂盒说明书操作测定炎症因子NO、MDA、PGE2、TNF-α和IL-1β的含量。
将大鼠仰卧位固定，酒精擦拭消毒后用手术剪剪开胸腹部皮肤，暴露肌肉层，往胸腔内注入2 mL 生理盐水胸腔洗液（含5 U/mL 肝素）[11-12]，轻轻摇晃，使胸腔内液体混合均匀；
取胸腔渗出液，于5 000 r/min 条件下离心5 min，取上清液，按试剂盒说明书测定MDA、PGE2、TNF-α和IL-1β的含量。
1.2.4 数据统计与分析 采用SPSS19.0 统计分析软件处理，实验数据用（平均值±标准差）表示，采用t检验及单因素方差分析。p＜0.05 表示差异有统计学意义。
2.1 地胆草提取物含量
结果显示，地胆草乙醇提取物提取率为30.58%，提取物1 g 相当于原生药3.27 g。本研究选择最高剂量为浸膏原液，将中、低剂量进行了相应稀释。
2.2 血清中炎症因子含量
血清中炎症因子含量如表1 所示。与阴性对照组比较，阳性对照组明显降低了血清中NO、MDA、PGE2、TNF-α和IL-1β的含量（p＜0.05 或p＜0.01）；
地胆草乙醇提取物不同剂量组均可不同水平降低血清中炎症因子的含量。与阴性对照组相比，高、中、低剂量组均可明显降低血清中TNF-α含量（p＜0.05 或p＜0.01），高剂量组与阳性对照组无显著差异；
高、中剂量组明显降低了（p＜0.05 或p＜0.01）血清中NO、MDA 和IL-1β含量，其中高剂量组对MDA、TNF-α和IL-1β的影响显著优于中剂量组；
只有高剂量组显著降低了血清中PGE2含量。
表1 大鼠血清中炎症因子含量[（x ± s），n=6]
2.3 胸腔液中炎症因子含量
胸腔液中炎症因子含量结果如表2 所示。与阴性对照组比较，阳性对照组明显降低了（p＜0.05或p＜0.01）胸腔液中MDA、PGE2、TNF-α和IL-1β含量；
地胆草乙醇提取物的3 个剂量组均明显降低了（p＜0.05）胸腔液中TNF-α的含量；
中剂量组和高剂量组明显降低了（p＜0.05 或p＜0.01）胸腔液中MDA、PGE2和IL-1β的含量，且高剂量组对PGE2的影响显著高于中剂量组，效果和阳性对照组无显著性差异。
表2 大鼠胸腔液中炎症因子含量[（x ± s），n＝6]
3.1 讨论
角叉菜胶诱导的大鼠急性胸膜炎被广泛应用于抗炎药物的筛选与评价，是一种理想的急性渗出性炎症模型[13]。炎性刺激可引起大量炎性介质的分泌，易于检测出与炎症反应相关的因子水平[14-16]，故大鼠胸膜炎炎症介质含量可作为衡量炎症的重要指标。
NO 能调节炎症反应，炎症发生时，刺激物促进NO 的合成和释放，进而促进炎症反应进行；
MDA 可反应机体自由基与脂类反应的情况；
PGE2在炎症反应中发挥重要作用，能够促进其他因子作用，使白细胞聚集在炎性区域，从而引起组织水肿、充血等炎症反应[17]；
TNF-α是一种促炎性因子，可通过多种生物学途径诱发或激活体内产生多种炎症介质，炎症介质共同作用引起组织损伤和细胞凋亡[18-19]；
IL-1β是参与炎症反应最重要的细胞因子之一，可以增加PGE2的分泌，参与介导急性炎症反应，促进白细胞聚集在局部炎症部位。本试验中，地胆草乙醇提取物能够降低血清和胸腔液中NO、PGE2、TNF-α和IL-1β的含量，降低MDA 的含量，表明地胆草乙醇提取物抑制大鼠急性胸膜炎的作用机制可能与其抗氧化和抑制炎症因子释放有关。
Wan 等[20]研究发现，高浓度地胆草乙醇提取物能够作为乙醇诱导的肝损伤保肝药物，减轻肝脏的损伤情况，且大鼠口服地胆草提取物安全无毒副作用。为探究地胆草水提物的抗炎效果，温先敏等[21]建立了角叉菜胶诱导的大鼠足趾肿胀模型，并比较各组大鼠给药后不同时间右后足趾肿胀度及抑制率，结果发现，当给药剂量为0.45 g/kg（约相当于生药量38.67 g/kg）时对足趾肿胀有抑制作用。为测试地胆草不同溶剂提取物的半数致死量（LD50），有关学者对地胆草不同溶剂提取物进行了大鼠急性毒性试验，结果表明，提取物在5 000 mg/kg（约相当于生药量16.35 g/kg）的剂量下，大鼠未出现死亡情况[22]。按照0.4 g/kg剂量（约相当于生药量8.25 g/kg）给炎症模型大鼠灌服地胆草提取物，研究发现，与对照组相比，给药组对角叉菜胶诱导的炎症有明显的抑制作用[23]。本试验中使用的浸膏质地粘稠，且高剂量组使用浸膏原液，为保证灌胃药液的流动状态，最终设置剂量分组为：低剂量组（按生药量计为7.5 g/kg）、中剂量组（按生药量计为15 g/kg）、高剂量组（按生药量计为30 g/kg）。
3.2 结论
本研究结果表明，地胆草乙醇提取物能抑制角叉菜胶诱导的急性胸膜炎大鼠胸腔液和血清中NO、MDA、PGE2、TNF-α和IL-1β的含量，抗炎效果为高剂量＞中剂量＞低剂量，初步提示其抗炎机制可能与其抑制炎症因子的释放及抗氧化作用有关。
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