胡文森 ，杨路宽，栾奕
1.贵州食品工程职业学院（贵阳 551400）；
2.贵州勘设食品安全科技有限公司（贵阳 550018）
维生素B6（vitamin B6）也叫吡哆素，包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺，在人体内以磷酸酯的形式存在，是人体内某些辅酶的组成成分，参与多种代谢反应，特别是和氨基酸代谢有密切关系。长期缺乏维生素B6会使皮肤、中枢神经系统及造血机能的损伤。其主要测定方法有毛细管电泳法、超临界流体色谱及高效液相色谱法（HPLC）等[1]。
维生素B1（vitamin B1），又称硫胺素或抗神经炎素，以辅酶形式参与体内糖的分解代谢，具有神经保护功能，还可以促进肠胃蠕动，增加食欲，是一种常见的辅助药物。长期缺乏维生素B1会造成糖代谢障碍，引起多发性神经炎及脚气病。其测定方法主要有紫外-可见分光光度法、荧光分光光度法、化学分析法、HPLC等[2]。
烟酰胺（nicotinamide）又名尼克酰胺，是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（辅酶Ⅰ）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（辅酶Ⅱ）的重要组成部分，与人体内脂质代谢、组织呼吸的氧化过程以及糖类无氧分解过程有密切的联系[3]；
主要存在于肾、肝、肌肉、乳汁、蛋黄、花生和水果中[4]，对糙皮病有预防作用。在蛋白质和糖类的代谢中发挥作用，提高人类和动物的营养，可作化妆品的营养性添加剂，医药及食品、饲料添加剂。
在运用GB/T 5009.197—2003《保健食品中盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、烟酰胺和咖啡因的测定》[5]对相关指标进行检测时发现，盐酸吡哆醇保留时间在22 min左右，运行时间较长，且盐酸吡哆醇峰极易与杂峰相连，难达到最小分离度，给实验者带来不便。试验将流动相更换为0.1%三氟乙酸-甲醇，梯度洗脱，其他色谱条件不变，在保证烟酰胺和盐酸吡哆醇同时检测的基础上，使目标峰与杂质峰实现更好分离，且缩短检测时间、降低检测成本。通过对检测结果线性、准确性、回收率、稳定性验证，给后续试验提供参考。
1.1 仪器与试剂
赛默飞U-3000高效液相色谱仪（配二极管阵列检测器，美国赛默飞世尔公司）；
电子天平[0.1 mg，XP 205，梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司]；
涡旋振荡器（MultiReax，德国Heidolph）。
贵阳市随机购买的十款保健食品，均在产品标注的保质期内。
三氟乙酸（分析纯，源叶生物）；
癸烷磺酸钠（离子色谱纯，SIGMA）；
硫酸月桂酯钠（离子色谱纯，上海麦克林生化科技有限公司）；
乙腈（色谱纯，默克股份有限公司）；
甲醇（色谱纯，默克股份有限公司）；
磷酸[分析纯，重庆川东化工（集团）有限公司]；
烟酸（0.25 g，DR.Ehrenstorfer GmbH）；
烟酰胺（0.25 g，DR.Ehrenstorfer GmbH）；
盐酸吡哆醇（纯度≥99.0，广州沃恩生物科技有限公司）；
盐酸吡哆醛（纯度≥99.0，广州沃恩生物科技有限公司）；
盐酸吡哆胺（纯度≥99.0，广州沃恩生物科技有限公司）；
盐酸硫胺素（纯度≥99.0，广州沃恩生物科技有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 标准溶液的制备
分别准确称取适量烟酸、烟酰胺、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、盐酸吡哆醛和盐酸吡哆胺标准品，用水稀释并定容，扣除纯度后得到标准储备液，质量浓度均为1 000 μg/mL。将各标准储备液逐级稀释，配制成质量浓度为0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0和50.0 μg/mL的系列混合标准工作液。
1.2.2 样品前处理
固体试样：取20粒以上片剂或胶囊试样研磨或混匀，称取1 g（准确至0.001 g）试样于刻度试管中，加入10 mL甲醇-水-磷酸（100∶400∶0.5，V/V）混合溶液，混匀，超声萃取5 min后以3 000 r/min离心5 min，上清液经0.22 μm有机滤膜过滤后待进样。
液体试样：取1 g（准确至0.001 g）试样于刻度试管中，直接用甲醇-水-磷酸（100∶400∶0.5，V/V）混合溶液定容至10 mL，充分混匀后经0.22 μm有机滤膜过滤后待进样。
试样处理液中浓度超出标准工作液范围的，用甲醇-水-磷酸（100∶400∶0.5，V/V）混合溶液稀释至适当浓度后重新进样。
1.2.3 色谱条件
色谱柱为ZORBAX SB-C18（4.6×250 mm，5 μm）或同等性能的色谱柱，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，波长280 nm，流动相为0.1%三氟乙酸-甲醇，梯度洗脱。
2.1 色谱条件的优化
在GB/T 5009.197—2003中，以癸烷磺酸钠溶液-乙腈-磷酸（850∶150∶1，V/V）为流动相，如图1所示，盐酸吡哆醇的保留时间在22 min左右，检测时间较长，且盐酸吡哆醇出峰附近有杂峰。即使更改流动相比例也无法实现目标峰完全分离，容易造成检测结果不准确。
将流动相替换为0.1%三氟乙酸-甲醇梯度洗脱，洗脱程序如表1所示。标准品色谱图与阳性样品色谱图如图2和图3所示。
表1 高效液相色谱梯度洗脱条件
图2 标准品色谱图
图3 阳性样品色谱图
由图2和图3对比可知，样品中目标物质保留时间大幅提前，而且没有出现杂峰干扰的情况。
2.2 方法的线性关系
在上述色谱条件下，配制系列质量浓度混合标准溶液，以响应峰面积（y）对标准的质量浓度（x）做校正曲线，得到线性回归方程和相关系数，如表2所示。
表2 6种化合物的线性关系
2.3 回收率、精密度与检出限
试验选择阴性的样品作基质进行加标回收。在线性范围内，以高、中、低3个不同浓度进行加标回收测试。如表3所示，样品中各物质的回收率在90%～102%，相对标准偏差均＜5%，符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范》的要求（当含量满足1 mg/kg＜X≤100 mg/kg时，回收率范围为90%～110%；
当含量满足10 mg/kg＜X≤1 000 mg/kg时，检测结果的准确度偏差＜15%），表明该方法结果准确。
表3 保健食品中各种维生素的添加回收率结果
根据GB/T 5009.1—2003《食品卫生检验方法理化部分总则》规定，把3倍空白值的标准偏差（测定次数≥20）相对应的质量或浓度称为检出限[6]。在最优试验条件下，以信噪比rSN=3为方法检出限（limit of determination，LOD）。试验中，当称样量为1.00 g，定容体积10 mL时，烟酸、烟酰胺的检出限为0.004 mg/kg，盐酸吡哆醇、盐酸吡哆醛和盐酸吡哆胺的检出限为0.001 mg/kg，盐酸硫胺素检出限为0.002 mg/kg。
2.4 实际样品检测分析
采用本方法对市场上的10个保健食品样品进行检测，试验结果如表4所示。
表4 保健食品中维生素的测试结果
试验改进高效液相色谱法同时检测保健食品中烟酰胺、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素的含量，在波长280 nm和260 nm下，用流动相为0.1%三氟乙酸-甲醇，梯度洗脱，流速1.0 mL/min，实现目标峰与杂质峰有更好的分离，且缩短检测时间。该方法操作简便、准确度高、重复性好、稳定性强、回收率高，可作为保健食品中烟酰胺、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素同时检测的分析方法。
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