龚频，徐珂，马天有 ，窦建卫
1.陕西科技大学食品科学与工程学院（西安 710021）；
2.西安交通大学公共卫生学院（西安 710065）；
3.西安交通大学药学院（西安 710065）
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种神经退行性疾病，其症状表现为认知障碍、记忆功能障碍等，严重影响患者的生活质量[1]。据流行病学统计显示，全球患阿尔兹海默病人数已超2 700万人，已成为严峻的社会公共卫生问题[2]。AD的主要诱因有淀粉样蛋白、自噬紊乱、神经炎症、Ca2+紊乱、线粒体损伤等[3]。目前，AD的发病机制尚不清楚，主要有胆碱能损伤假说[4]、β淀粉样蛋白毒性假说[5]、Tau蛋白假说等[6]。
AD的病理学特征包括受影响的脑区产生广泛的氧化应激、胆碱功能障碍、淀粉样斑块、神经元纤维缠结以及神经元丢失等[7]。为寻求有效的防治手段，研究者从不同机制出发，开发了不同的体外动物模型，其中腹腔注射东莨菪碱致胆碱能系统功能障碍、氧化应激增加而使学习记忆能力下降的建模方法，因具有操作简便、经济的优点而被广泛应用[7]。
从中医学角度分析AD的发病机制，AD属“呆病”“善忘”“痴呆”“健忘”的范畴。因此，AD的病机根本为肾虚，治疗上应以补肾为主[8]。此试验拟利用腹腔注射新技术，构建小鼠学习记忆损伤动物模型，并以小鼠为试验对象，对其进行干预，研究筑青生命活素固体饮料对小鼠学习记忆能力的改善作用。
1.1 主要材料与试剂
1.1.1 试验动物
SPF级c57bl/6雄性小鼠，3月龄，50只，西安交通大学动物中心，饲养于SPF级动物房，12 h光照/黑暗循环（6：00-18：00），室内温度保持在23±2 ℃，湿度保持在40%～70%，可自由获取食物和饮水。
1.1.2 主要药品与试剂
筑青生命活素固体饮料（陕西筑青健康生物医药科技有限公司，生产批号：220910）；
东莨菪碱（MCE公司，HY-N0296）；
超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD，上海江莱科技有限公司，JL12237）；
过氧化氢酶（Catalase，CAT，上海江莱科技有限公司，JL18163）；
乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AchE，上海江莱科技有限公司，JL20661）；
丙二醛（Malondialdehyde，MDA）测试盒（索莱宝公司，BC0020）；
乙酰胆碱（Acetylcholine，Ach）测试盒（南京建成，A105-1）；
羟自由基含量试剂盒（上海江莱科技有限公司，JL-T1058）；
DPPH试剂盒（南京建成，A153-1）；
其他试剂均为分析纯级别。
1.2 主要仪器与设备
DV215CD万分之一分析天平（美国奥豪斯公司）；
YLS-3TB跳台记录仪（济南益延科技有限公司）；
Smart3.0Morris水迷宫（Panlab）；
SPARK全波长酶标仪（上海帝肯实验器材有限公司）；
L5S紫外可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 动物分组、给药与造模
SPF级c57bl/6雄鼠50只，自适应饲喂7 d后，将其随机分成5组，分别为：空白组（正常饲养）、模型组（生理盐水0.6 mL）；
根据项目要求按照说明书用量换算后试验低剂量组（5倍人体推荐剂量，21.45 g生药/kg）、中剂量组（10倍人体推荐剂量，42.9 g生药/kg）、高剂量组（20倍人体推荐剂量，85.8 g生药/kg）。每组10只，连续灌胃给药15 d。每隔7 d称量记录动物体重调整给药剂量。
灌胃试验结束后第2天进行跳台试验的训练，在训练前20 min除空白组以外所有动物腹腔注射东莨菪碱2 mg/kg，构建小鼠学习记忆障碍模型[9]。流程图如图1所示。
图1 筑青生命活素固体饮料改善学习记忆试验流程图
图2 筑青对c57bl/6小鼠体重变化的影响
1.3.2 跳台试验
先将小鼠置于试验箱内进行3 min的适应性训练，然后接通试验箱底部回路5 min，36 V的电压，对小鼠进行电击刺激，然后跳到隔离平台上，排除掉不能跳到平台上的小鼠。试验结束后，将其置于绝缘平台上，进行5 min的连续观测，并对其各组小鼠第1次从平台跳下所需的时间，即跳台潜伏期（step down latency，SDL）和观察期内跳下平台的错误次数（error times，ET）进行记录[10]。在观测期间，如果试验动物没有离开平台，ET记录为0，SDL记为观察时间5 min。分别记录每组小鼠的潜伏期及错误次数，作为测试期成绩，经过24 h后进行重测期试验。在停训7 d后，采用重测期试验方法，对小鼠进行消退期试验。
1.3.3 Morris水迷宫试验
近日，金钼股份技术中心科研团队经过技术攻关，成功制备出了外径8 mm、壁厚0.6 mm、长度达8 m的无缝钼合金薄壁管，一举攻克了大长径比无缝钼合金薄壁管的关键技术。
定向航行试验：训练前20 min除空白组以外所有动物腹腔注射东莨菪碱2 mg/kg建立痴呆模型，试验过程中保持平台的位置不变，将小鼠面向池壁提示物方向分别从一、二、三、四象限轻轻放入水中，并记录其寻找平台的时间，以此为逃避潜伏期。试验动物上台10 s后自动停止采集。若在60 s规定时间内未找到平台，则将逃避潜伏期记作60 s，然后人工引导其上平台并停留30 s。
空间探索试验：完成定向航行试验后，取下平台，将试验鼠从目标区的反方向象限投放到池中，进行自主探索90 s，记录指定时间内完成在原平台位置上游泳的时间、距离和穿台次数等指标[11]。
1.3.4 氧化应激及神经递质相关指标的测定
行为学测试结束后，动物腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，眼球取血，并断头取脑组织，于-80 ℃冰箱保存。根据试剂盒的说明，称取脑组织并提取组织上清液，对各组小鼠血清与脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性，MDA水平及脑组织中乙酰胆碱（Ach）水平、乙酰胆碱酯酶（AchE）活性进行测定。
1.3.5 自由基清除能力测定
按照试剂盒说明书称取小鼠脑组织提取组织上清，检测各组小鼠血清与脑组织中DPPH、羟自由基含量。
1.3.6 数据处理与统计
通过SPSS 22.0统计软件GraphPad对所得的数据进行统计分析，所得数据均以均值±相对标准偏差（）表示。应用t检验方法对两组进行成比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 筑青生命活素固体饮料对c57bl/6小鼠动物体重变化的影响
经15 d给药及7 d行为学检测，在给药期间空白组小鼠生长情况良好，体重平稳增加，模型组和筑青生命活素固体饮料给药组生长情况与空白组相比无显著差异；
行为学检测后给药组体重减少，与模型组相比无统计学差异。结果表明，筑青生命活素固体饮料给药组小鼠生长情况良好，体重平稳增加，说明筑青生命活素固体饮料对小鼠生长无影响。
2.2 筑青生命活素固体饮料对小鼠跳台试验的影响
与空白组相比，测试期模型组跳台试验潜伏期明显缩小，错误次数增加，具有统计学差异（P＜0.05），表明东莨菪碱致痴呆小鼠学习记忆能力明显减退，表现为一定的痴呆症状。与模型组相比，筑青生命活素固体饮料给药组小鼠潜伏期延长，错误次数减小，具有统计学差异（P＜0.05）。结果见表1。重测期筑青生命活素固体饮料给药组与模型组相比小鼠潜伏期增加、错误次数减少，具有统计学差异（P＜0.05）；
消退期筑青生命活素固体饮料给药组与模型组相比小鼠潜伏期，错误次数差异较小无统计学意义。结果见表2。
表1 筑青对测试期小鼠跳台试验的影响（n=10，）
表1 筑青对测试期小鼠跳台试验的影响（n=10，）
表2 筑青生命活素固体饮料对小鼠重测期及消退期跳台试验的影响（n=10，）
表2 筑青生命活素固体饮料对小鼠重测期及消退期跳台试验的影响（n=10，）
东莨菪碱可通过阻滞M1型突触后受体，损害海马区的记忆，从而导致记忆获得障碍[12]。在小鼠跳台试验中，筑青生命活素固体饮料给药组与模型组相比重测期小鼠跳台试验的潜伏期延长、错误次数减少；
消退期筑青生命活素固体饮料给药组与模型组相比，潜伏期、错误次数无统计学意义，说明筑青生命活素固体饮料可以改善东莨菪碱所致的痴呆，但这种改善不能长期维持。
2.3 筑青生命活素固体饮料对小鼠空间记忆的影响
1) 在定位航行阶段，与空白组相比，模型组在定位航行的4 d里寻找平台潜伏期时间和总路程均增加，具有统计学差异（P＜0.05），表明东莨菪碱致痴呆小鼠模型建立成功。筑青生命活素固体饮料给药组在第1天与模型组相比寻找平台潜伏期时间和总路程减少但无统计学差异；
筑青生命活素固体饮料中剂量给药组在第2天与模型组相比寻找平台潜伏期时间和总路程减少，具有统计学差异（P＜0.05）；
筑青生命活素固体饮料低剂量给药组在第3天与模型组相比寻找平台潜伏期时间和总路程减少，具有统计学差异（P＜0.05）；
筑青生命活素固体饮料低、中、高剂量给药组在第4天与模型组相比寻找平台潜伏期时间和总路程减少，具有统计学差异（P＜0.05）。结果见表3和表4。
表3 筑青生命活素固体饮料对小鼠Morris水迷宫定向航行逃避潜伏期的影响（n=10，）
表3 筑青生命活素固体饮料对小鼠Morris水迷宫定向航行逃避潜伏期的影响（n=10，）
表4 筑青生命活素固体饮料对小鼠Morris水迷宫定向航行游泳总路程的影响（n=10，）
表4 筑青生命活素固体饮料对小鼠Morris水迷宫定向航行游泳总路程的影响（n=10，）
2) 在空间探索阶段与空白组相比，在目标象限区，模型组的相对游动时间、相对游动距离及穿越平台次数均显著降低（P＜0.05）；
与模型组比较，筑青生命活素固体饮料给药组的小鼠在目标象限区的相对游动时间、相对游动距离、穿越平台的次数均有显著性差异（P＜0.05）。结果如表5所示。
表5 筑青生命活素固体饮料对小鼠Morris水迷宫空间探索的影响（n=10，）
表5 筑青生命活素固体饮料对小鼠Morris水迷宫空间探索的影响（n=10，）
以上结果可能与筑青生命活素固体饮料中覆盆子具有补肾、化痰祛瘀的作用，从而能够有效调节学习记忆障碍有关。覆盆子的氯仿部位、正丁醇部位、乙酸乙酯部位和水部位均可不同程度缩短小鼠的逃避潜伏期，增强小鼠的空间探索能力，并且在一定程度上改善东莨菪碱所致的学习记忆障碍小鼠的学习记忆能力[13-15]。
2.4 筑青生命活素固体饮料对氧化应激指标的影响
与空白组相比，模型组小鼠血清中SOD、CAT含量减少，MDA含量增加，具有统计学差异（P＜0.05），表明模型小鼠氧化损伤增加，自由基清除能力减弱。与模型组相比，筑青生命活素固体饮料给药组小鼠血清中SOD含量增高，其中高剂量组为6.03±1.59 ng/mL（P＜0.05），中剂量组为5.91±3.12 ng/mL（P＜0.05）；
筑青生命活素固体饮料给药组小鼠血清中CAT含量增高，其中高剂量组为2 349.51±130.48 pg/mL（P＜0.05）；
筑青给药组小鼠血清中MDA含量减少，无统计学意义。结果如图3所示。
图3 筑青生命活素固体饮料对小鼠血清和脑组织中氧化应激指标的影响
与空白组相比，模型组小鼠脑组织中SOD、CAT含量减少，MDA含量增加，具有统计学差异（P＜0.05）。与模型组相比，筑青生命活素固体饮料给药组小鼠脑组织中SOD含量增加，其中高剂量给药组为12.70±1.53 ng/mL（P＜0.05）；
筑青生命活素固体饮料给药组小鼠脑组织中CAT含量增加，其中高剂量组为4 538.89±671.82 pg/mL（P＜0.05）；
筑青生命活素固体饮料给药组小鼠MDA含量减少，其中中剂量组为89.35±24.67 nmol/mL（P＜0.05），高剂量组为86.36±22.42 nmol/mL（P＜0.05）。以上结果说明筑青生命活素固体饮料可以提高机体的抗氧化能力。结果如图3所示。
氧化应激是在高应激条件刺激下，促氧化剂和抗氧化剂之间处于不平衡的状态，导致分子和细胞损伤[16]。氧化应激在AD发生发展中发挥了重要的作用。大脑中脂质含量丰富，同时由于线粒体呼吸链耗氧较高，容易受到氧自由基的侵袭[17]。MDA是人体内一种重要的脂质过氧化产物，它的水平高低能反映机体内的过氧化程度[18]；
作为平衡体内氧化应激水平的抗氧化系统的重要组成，SOD能有效清除活性氧自由基，过氧化氢酶（CAT）能够催化过氧化氢分解成氧和水，其水平高低能反映机体清除自由基的能力[19]。结果显示，筑青生命活素固体饮料作用能够增加小鼠脑组织和血清中SOD、CAT活性，减少MDA含量，血清和脑组织中羟自由基含量减少，脑组织中DPPH清除能力增强，可能通过筑青生命活素固体饮料配方中的覆盆子发挥作用，已有研究[20-21]表明覆盆子含有高含量的超氧化物歧化酶和花青素，具有很强的抗氧化能力。
2.5 筑青生命活素固体饮料对神经递质指标的影响
胆碱能系统损伤被认为是AD发生的重要因素之一[22]。AD患者的临床表现与其乙酰胆碱水平降低有密切关系[23]。乙酰胆碱（ACh）是生物化学基础，其含量减少可导致学习记忆功能障碍[24]。AchE是脑内与学习记忆相关的重要的酶类之一，可分解突触间隙的神经递质乙酰胆碱，使乙酰胆碱含量降低；
AchE活性增加会导致脑内学习记忆活动障碍[25]。黄丽萍等[26]研究发现覆盆子氯仿部位高、低剂量组，覆盆子乙酸乙酯部位高、低剂量组均能不同程度改善痴呆大鼠学习记忆能力，降低皮层AchE活性，升高乙酰胆碱转移酶活性。
与空白组相比，模型组小鼠脑组织中Ach含量减少，具有统计学差异（P＜0.01）。与模型组相比，筑青生命活素固体饮料给药组小鼠脑组织中Ach含量增加，其中高剂量组为2.15±0.54（P＜0.01）；
模型组与空白组相比和筑青生命活素固体饮料给药组与模型组相比小鼠脑组织Ach E含量均无统计学差异。表明筑青生命活素固体饮料可通过促进Ach的释放，发挥改善学习记忆能力。结果如图4所示。
图4 筑青生命活素固体饮料对小鼠脑组织中神经递质指标的影响
2.6 筑青生命活素固体饮料对自由基清除能力的影响
与空白组相比，模型组小鼠血清和脑组织中羟自由基含量增加，具有统计学差异（P＜0.05，P＜0.01）。与模型组相比，筑青生命活素固体饮料给药组小鼠血清中和脑组织中羟自由基含量减少，其中高剂量减少最多，分别为5.17±0.26和5.52±2.79，具有统计学差异（P＜0.05，P＜0.01）。结果如图5所示。
图5 筑青生命活素固体饮料对小鼠自由基清除能力的影响
与空白组相比，模型组小鼠血清和脑组织中DPPH自由基清除能力减弱，具有统计学差异（P＜0.05）。与模型组相比，筑青生命活素固体饮料给药组小鼠血清中DPPH自由基清除能力无统计学差异；
筑青中、高剂量给药组小鼠脑组织中DPPH自由基清除能力增加，分别为43.97±5.15和52.32±2.71，具有统计学差异（P＜0.05）。结果如表5所示。
根据此研究结果可知，筑青生命活素固体饮料对小鼠生长无影响，通过采用腹腔注射东莨菪碱来建立记忆获得障碍模型，利用小鼠跳台和Morris水迷宫经典方法证明该产品可以改善东莨菪碱所致的痴呆，但这种改善不能长期维持。结果显示，筑青生命活素固体饮料作用能够增加小鼠脑组织和血清中SOD、CAT活性，减少MDA含量，血清和脑组织中羟自由基含量减少，脑组织中DPPH清除能力增强，可能通过筑青生命活素固体饮料配方中的覆盆子发挥作用，作用机制可能与平衡大脑胆碱能系统，缓解氧化应激损伤有关，但是具体物质基础和作用方式还有待进一步研究。
综上所述，该产品可以改善东莨菪碱所致痴呆小鼠的学习记忆障碍，但记忆改善具体作用通路还需要深入的探究。
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