赵桂新 , 白和平 , 陶 勇 , 张 闫 ,刘 畅 , 张志强 , 吴同垒 , 史秋梅
(河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室,河北 秦皇岛 066604)
棒状杆菌属细菌(Corynebacterium)可引发人与多种动物患病,总称为棒状杆菌病,主要临床表现为多种组织和器官发生化脓性或干酪样病变[1]。棒状杆菌属是高度多样化的细菌,目前有110多种,其中干燥棒状杆菌(Corynebacteriumxerosis)是存在于人类皮肤和粘膜中的一种共生生物[2]。干燥棒状杆菌能够导致人的化脓性关节炎[3],以往有学者认为该菌只有在非正常部位寄居、机体抵抗力下降或外伤感染时才致病,被认为是人畜共患的一般条件性致病菌[4]。如今抗生素频繁应用大大增加了该菌的耐药性,越来越多报道证明该菌属确实在机体抵抗力下降时会引起各类感染,能够引起严重的致命性疾病。现已报道棒状杆菌属的优势致病菌种有假结核棒状杆菌[5]、纹带棒状杆菌[6]和白喉棒状杆菌[7],其中白喉棒状杆菌危害最重,对其报道也最多;纹带棒状杆菌次之;假结核棒状杆菌较少;还有多种棒状杆菌属成员被陆续报道,该菌属的潜在致病性已经得到重视。人类医学相关研究表明,棒状杆菌是人类皮肤常见菌群之一[8-9],然而在动物方面关于干燥棒状杆菌报道的比较少,虽然该菌是一种条件致病菌,并不会引起肉牛的死亡,但是当动物机体抵抗力下降时,会对牛的皮肤、粘膜造成严重的危害。因此对该菌的研究具有非常重要的生理卫生意义,本研究为干燥棒状杆菌的防控提供了依据。
1.1 主要试剂与仪器
绵羊血琼脂平板,购自郑州安图生物工程有限公司;抗生素(泰乐菌素、头孢拉定、青霉素、土霉素、磺胺间甲氧、大观霉素、磺胺二甲氧、对氧氟沙星、林可霉素、对环丙沙星、恩诺沙星、替米考星、氨苄西林、卡那霉素、多西环素、阿莫西林、头孢曲松、新霉素)药敏纸片,均购自北京索莱宝科技有限公司;细菌DNA提取试剂盒,购自Aidlab公司;ID32E生化鉴定试纸条、革兰氏染色试剂盒,均购自北京博奥阔达生物科技有限公司;pMD-18T载体、2×Taq PCR Master Mix,均购自宝生物工程(大连)有限公司;DH-5ɑ感受态细胞,购自康为世纪生物科技有限公司;ATB全自动生化鉴定仪,购自法国梅里埃生物公司;PCR扩增仪,购自杭州朗科学仪器公司。
1.2 样品来源
病样取自某养殖场4个月左右体型消瘦、呼吸道症状较明显的患病牛只,使用灭菌棉签,深入鼻腔深处蘸取鼻腔黏液,放置4 ℃送至河北省预防兽医学重点实验室。
1.3 引物设计与合成
rpoB基因为RNA聚合酶β亚基编码基因,适用于棒状杆菌的鉴定,是16S rRNA基因鉴定的补充方法[10]。因此,参考Khamis等[11]文章中rpoB基因和16S rRNA基因序列,由上海生物工程有限公司合成特异性引物,引物信息见表1。
表1 引物信息Table 1 Primer information
1.4 分离菌的形态学鉴定
在超净台中取出鼻拭子,将其放入15 mL EP管内并在管内添加灭菌PBS缓冲液5 mL,随后充分旋转挤压使鼻拭子中携带的牛鼻腔黏液充分浸入PBS缓冲液内,5 000 rpm室温离心2 min,弃掉上清并用移液枪吸净后用1 mL LB重悬菌体,使用接种环取一环菌悬液,在血琼脂培养基上进行四区划线,37 ℃培养过夜,将分离的优势菌落在血琼脂培养基上纯化培养[10],并命名为CX-21。
1.5 分离菌生化鉴定
挑取血琼脂培养基上纯化的细菌培养物,使用灭菌生理盐水与比浊仪调整菌悬液为0.5麦氏比浊度;取出ID 32E生化鉴定卡,每孔添加55 μL菌悬液,0～6孔滴加1滴石蜡油,37 ℃培养24 h,在鉴定卡读取结果之前于00孔(IND孔)滴加1滴JAMES用于吲哚反应;然后使用ABI全自动生化检定仪鉴定菌种,相关操作按照使用说明执行。
1.6 PCR检测
以提取的细菌基因组DNA为模板,使用1492R、27F引物扩增分离菌的16S rRNA基因,退火温度为55 ℃;使用rpoB-C2700F/R引物扩增rpoB基因,退火温度为60 ℃。挑取纯化后的单菌落,接种于5 mL无抗生素的 LB液体培养液中,37 ℃、200 rpm培养24 h,按Aidlab公司的细菌DNA快速提取试剂盒中的说明书方案提取细菌的基因组DNA,-20 ℃保存备用。扩增体系为20 μL,其中2×Taq PCR Master Mix 10 μL,上游引物、下游引物、细菌基因组DNA各1 μL,超纯水补足充至20 μL,反应程序为94 ℃预变性5 min,94 ℃变性45 s,55℃/60 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,30个循环,72 ℃终延伸10 min。取PCR扩增产物5 μL,经1%的琼脂糖凝胶水平电泳检测,条带大小符合预期大小可判断为阳性。
1.7 分离菌16S rRNA基因序列比对分析
待16S rRNA基因的PCR产物电泳后,进行切胶纯化,将纯化产物连接至pMD-18T载体上,随后将加入待用DH5ɑ大肠杆菌感受态细胞中,冰浴30 min,42 ℃热激30 s,冰浴2 min后在超净台中立即加入1 mL无抗生素LB并在37 ℃、200 rpm复壮1 h,5 000 rpm离心2 min,弃上清,用200 μL ddH2O重悬菌体涂在LB固体培养基中,37 ℃过夜培养。次日,挑取单克隆于LB液体培养基中37 ℃、200 rpm摇菌后进行PCR验证。经鉴定的阳性菌株送上海某生物工程有限公司测序,将测序后序列在NCBI中进行Blast比对分析,同时下载与干燥棒状杆菌同种属菌株的16S rRNA序列,利用MEGAN 7.0软件进行序列分析比较,并使用MegALign软件计算一致性。
1.8 抗生素药敏试验
按照美国临床实验室标准委员会推荐的K-B试纸法检测分离菌的药物敏感性,在超净工作台中,使用涂布棒将培养至0.5麦氏浊度的菌液均匀的涂在血琼脂培养基上,取3个不同位置贴上药敏纸片,在37 ℃静置培养24 h后,用量尺来测量抑菌圈的直径,以此来判定细菌对相应抗菌药物的敏感程度。并按照相关标准执行试验操作与结果判定,取3次重复药敏试验抑菌圈的直径平均值作为最终药敏试验结果。
2.1 分离菌的形态学鉴定
在血琼脂培养基上培养分离菌(见图1),24 h后可观察到该菌生长良好,中等大小且不规则的淡黄色菌落边缘粗糙呈凸起状,接种环不易挑起;在LB液体培养基中呈沉淀生长,菌液上层轻微浑浊,下层有颗粒状、片状沉淀;经革兰氏染色后,在油镜下观察该分离菌为排列不规则的阳性短杆状球菌。
图1 分离株菌落形态及染色结果A.为分离菌在血琼脂培养基上生长状态 B.为分离菌在LB培养基中生长状态 C.为分离菌经革兰氏染色在镜下观察状态(1000×)Fig.1 Isolated strain colony morphology and staining resultsA. Growth state of isolated bacteria on blood AGAR medium B. Growth state of isolated bacteria on LB medium C. Isolated bacteria observed under microscope by Gram staining
2.2 分离菌的生化鉴定
使用ID 32E生化鉴定卡鉴定分离菌的32种生化特性,结果如表2所示。分离菌CX-21能够发酵d-海藻糖、α-麦芽糖、d-麦芽糖、蔗糖;具有脂酶、赖氨酸脱羧酶、葡萄糖苷酶活性;不具有L-天冬氨酸芳胺酶、精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、尿素酶活性;不能发酵D-纤维二糖、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、古老糖、鼠李糖;不能利用D-甘露醇、山梨醇、D-阿拉伯醇、侧金盏花醇、肌醇、L-阿拉伯醇;β-N-乙酰葡萄糖胺、5-酮基葡糖酸盐、D-半乳糖酸盐同化、丙二酸盐、酚红试验为阴性;吲哚试验阴性。ATB全自动微生物鉴定仪结合判读结果,判定分离菌株CX-21符合干燥棒状杆菌生化特性。
表2 CX-21生化鉴定结果Table 2 Biochemical identification results of CX-21
2.3 PCR检测
PCR扩增后,取扩增产物5 μL经1%琼脂糖凝胶电泳,使用凝胶成像仪系统观察结果(见图2),可观察到1 483 bp的16S rRNA扩增条带与426 bp的rpoB基因扩增条带。
图2 CX-21 16SrRNA和rpoB基因电泳图 M.DL2000 plus DNA Maker,1.16S rRNA,2.rpoBFig. 2 Electrophoretogram of CX-21 16S rRNA gene and rpoB
2.4 分离菌16S rRNA基因序列比对分析
如图3所示,经过分析比对CX-21与干燥棒杆菌菌株DSM 20743、乳酸棒状杆菌RW2-5、棒状杆菌菌株NCFB 2768、CECT 5990、S160、溃疡棒杆菌菌株IMMIBL-1395的16S rRNA基因序列同源性均高达97%及以上;MEGAN 7.0分析结果显示,样品和干燥棒状杆菌自然聚为一簇,进一步证明分离菌为干燥棒杆菌。MegALign软件计算CX-21与干燥棒杆菌菌株DSM 20743、棒状杆菌菌株NCFB 2768、溃疡棒杆菌菌株IMMIB L-1395的一致性分别为91.6%、90.1%、88%。
图3 分离菌16S rRNA基因序列系统进化树构建结果Fig. 3 Phylogenetic tree construction results of the 16S rRNA gene sequence of the isolated bacteria
2.5 抗生素药敏试验
如表3所示,分离菌对泰乐菌素、头孢拉定、青霉素、土霉素、磺胺间甲氧、大观霉素、磺胺二甲氧耐药,对氧氟沙星、林可霉素中敏,对环丙沙星、恩诺沙星、替米考星、氨苄西林、卡那霉素、多西环素、阿莫西林、头孢曲松、新霉素极度敏感。
表3 CX-21 抗生素敏感性试验结果Table 3 CX-21 Antibiotic drug sensitivity test results
本研究从呼吸道症状明显的病牛鼻粘液中分离纯化到1株菌,经细菌纯化培养、革兰氏染色可得该分离菌符合棒状杆菌生长特性。由生理生化特性分析得到该分离菌表达酯酶活性与Palacio等[12]有关多数棒状杆菌具有酯酶活性的研究结果相符;其具有α-葡萄糖苷酶活性的结果与Renaud等[13]研究结果相符;该分离菌可发酵麦芽糖且具有α-葡萄糖苷酶活性,与温峰琴等[10]分离到的牦牛源干燥棒状杆菌不能发酵麦芽糖且无α-葡萄糖苷酶活性等生化特性的研究结果明显不符,可能与宿主以及环境因素有关,造成分离菌株的生化特性有所差异,但是能够发酵麦芽糖产酸和有很强的α-葡萄糖苷酶的活性,是少数能将干燥棒状杆菌与纹状体棒状杆菌和C.amycolatum区分开来的生化特性;对分离菌CX-21进行分子生物学鉴定,其rpoB基因PCR扩增产物检测结果为阳性,与温峰琴等[10]研究结果相符,16S rRNA基因鉴定与分析得出该分离菌在进化树上与干燥棒状杆菌位于同一进化分支,与棒状杆菌菌株进化关系较近为干燥棒状杆菌,表明分离菌CX-21为干燥棒状杆菌。通过药物敏感性试验进一步研究此菌株,选用18种常用抗生素类药物对其进行抗生素药敏试验,发现其耐药性比较严重,对氧氟沙星、林可霉素中敏,对泰乐菌素、头孢拉定等7种药物耐药,其多重耐药性的产生给该病的防治带来了严峻挑战。Vela等[14]从疑似丹毒猪的肺、有呼吸问题猪的肾和疑似副结核的山羊肝分离出该菌,本试验也是从患呼吸道疾病的鼻拭子中分离到该菌,但是否能够引起牛呼吸道疾病,还需进一步试验验证。
本研究分离纯化到一株肉牛源干燥棒状杆菌,其具有脂酶、赖氨酸脱羧酶、β-葡萄糖苷酶、α-葡萄糖苷酶活性,能够发酵海藻糖、麦芽糖、蔗糖,具有多重耐药性,为了解该菌的生物学特性提供了一定的参考,也为肉牛源干燥棒状杆菌的防控提供了参考依据。
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