张 蓉, 陈光吉, 尚以顺* ,梁宝山, 冉伟男,赵明坤,班宋智
(1. 贵州省农业科学院 草业研究所,贵州 贵阳 550006;2. 思南县宽坪乡农业服务中心,贵州 思南 565100; 3. 长顺县送智养殖场,贵州 长顺 550707)
在实际生产中,蛋鸡养殖常面临夏季高温带来的产蛋率下降和鸡只肠道健康问题。研究表明,高温环境下,家禽肠绒毛结构和肠粘膜的完整性易遭受损伤和破坏,进而引起宿主与菌群的微生态平衡被打破,形成肠道受损-菌群失衡-机体炎症的恶性循环,严重影响家禽生产性能,甚至导致死亡[1-3]。因此,改善高温环境条件下家禽的肠道屏障功能和微生物区系是缓解家禽高温暴露负面效应的重要途径。研究发现,植物提取物中的某些活性物质如黄酮类、多酚类、皂苷类等可通过抗氧化缓解高温引发的生产性能下降、畜禽疾病增加等问题[4-5]。如松针中的黄酮可显著提高氧化应激状态的肥胖大鼠肝脏中的抗氧化酶活性[6],槲皮素可以提高高温条件下奶牛乳腺上皮细胞的活性和抗氧化能力[7],白茶中提取的多酚类物质能够使机体纹状体细胞免受过氧化氢诱导的氧化应激损伤等[8]。现代药理研究发现,金荞麦(Fagopyrumdibotrys(D. Don) Hara)根茎中含有大量黄酮类、多酚类和有机酸类等抗氧化活性物质,同时金荞麦在夏季高温频发的南方地区的生物产量较高,充分挖掘其饲用价值和经济价值具有重要意义[9]。本课题组前期研究发现,在夏季高温条件下新鲜金荞麦替代10%的基础饲粮饲喂蛋鸡可维持原有产蛋率,且降低了血清中炎症因子和内毒素水平,但具体作用机理未知[10]。
闭合蛋白(Occluding)和Claudin是紧密连接主要的整合膜蛋白,在维持和调节紧密连接屏障功能中有重要作用。同时,肠道黏膜中上皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)是参与肠道上皮细胞的修复重要因子之一[11-12],因此Occluding、Claudin和EGF可作为肠道损伤程度和修复功能的表征指标。
基于此,本试验拟通过探究鲜饲金荞麦对夏季高温条件下蛋鸡肠道微生物区系及Occluding、Claudin和EGF的mRNA表达量的影响,进一步解析其作用机理,为挖掘金荞麦的饲用价值提供理论依据。
1.1 试验设计与饲粮
试验选取300只32周龄体重相近、健康的长顺绿壳蛋鸡,随机分为5组,每组5个重复,每个重复12只鸡。其中,C组饲喂基础饲粮,T1、T2、T3和T4组分别饲喂添加有5%、10%、15%和20%新鲜金荞麦的基础饲粮,5%、10%、15%和20%指的是新鲜金荞麦占饲喂饲粮的比例。为防止饲料霉变,每天现配现用。基础饲粮组成和营养水平见表1。
表1 基础饲粮组成和营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diets(air-dry basis)
1.2 饲养管理
采用三层式阶梯式笼养,每笼3只鸡。每天光照16 h,自由饮水,每天采摘新鲜的初花期金荞麦,用粉碎机粉碎后,与基础饲粮充分混合,每天喂食2次(9:00和16:00),现配现用。为避免因试验期延长导致金荞麦前后生育期不一致,借助金荞麦多年生的特点,试验前期便采用时间交错种植的方法,保障有足够数量的处于初花期的金荞麦供试验使用,最大程度保证新鲜金荞麦的成熟度稳定。试验时间为6月份～8月份,试验前关闭鸡舍湿帘降温装置,将试验鸡只暴露在当地自然高温条件下,并在鸡舍过道入口处、中间和鸡舍尾部分别悬挂1个挂壁式室内温湿度计(天津市美达时仪器仪表有限公司),分别在8:00、14:00和23:00记录鸡舍3个区域温度,表2中显示了6月份、7月份和8月份各时间点的平均温度和平均相对湿度值。预饲15 d,正试90 d。
表2 试验期各月每天各时间点的平均温度和平均相对湿度Table 2 Average temperature and average relative humidity at each time point of each day in each month of the trial period
1.3 样品采集及指标测定
1.3.1 肠段样品采集 于90 d试验结束后,每组选3只鸡,禁食12 h,采用无菌操作分别取十二指肠和回肠肠段的同一部位放入2 ml无RNA酶冻存管中,液氮保存,待测。
1.3.1.1 小肠总RNA提取与反转录 采用trizol法提取十二指肠和回肠组织总RNA,用核酸蛋白仪测其完整性、浓度和纯度。按照试剂盒Takara的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)说明合成cDNA,-20 ℃保存备用。
1.3.1.2 引物设计 根据GenBank测序数据库中鸡的GADPH(NM_204305.1)、occluding(NM_205128.1)、Claudin-1(AY750897.1)、EGF(NM_001001292.1)基因的mRNA序列,以GADPH作为内参基因,利用Primer Premier5.0引物软件分别设计扩增引物(西安淳风信息科技有限公司),引物序列见表3。
表3 引物序列Table 3 Primer sequences
1.3.1.3 实时荧光定量PCR 以合成的cDNA为模板,按照SYBR Premix Ex TaqTMII试剂盒说明,在实时荧光定量PCR仪上进行,反应条件为:95 ℃预变性3 min,95 ℃变性10 s,55 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,延伸完成采集荧光信号,共40个循环。采用相对定量分析法,以GADPH为内参基因,采用2-△△Ct计算目的基因mRNA相对表达量。
1.3.2 肠道内容样品采集 于90 d试验结束后,每组选3只鸡,禁食12 h,将回肠和盲肠内容物置于灭菌冻存管中,液氮速冻,待测。
1.3.2.2 测序 使用e.Z.N.A.TM Cycle-Pure Kit(omega)柱子将混好的样品进行胶前纯化,用Monarch DNA胶回收试剂盒进行回收,1.8%琼脂糖电泳检测,Qsep-400 方法质检合格后上机检测,根据illumina novaseq6000平台进行测序(北京百迈克生物科技有限公司)。
1.3.3 数据统计分析 试验数据用Excel进行整理,试验结果按单因子完全随机设计,调用SPSS 18.0软件的“一般线性模型(GLM)”程序进行方差分析,主效应为金荞麦在饲粮中的添加水平。然后用Duncan法进行多重比较,P<0.05表示差异显著。再调用“回归分析”中的线性(Linear)和二次(Quadratic)函数程序对基因表达量趋势进行分析,结果用平均值表示,各处理变异程度用标准误表示。
2.1 蛋鸡肠道目的基因mRNA表达量
由表4可见,试验因子显著影响了蛋鸡十二指肠和回肠中的Occluding和EGF的表达量(P<0.05),各处理Claudin-1的表达量无显著差异(P>0.05)。其中,十二指肠中的Occluding和EGF的表达量随金荞麦添加量的提高呈显著的二次上调趋势(P<0.05),以T2组表达量较高(P<0.05),而回肠中的表达量成显著的线性和二次上调的趋势(P<0.05)。
表4 蛋鸡肠道claudin-1、occluding以及EGF基因mRNA表达量Table 4 Expression of claudin-1, occluding and EGF gene mRNA in intestinal tract of laying hens
2.2 蛋鸡肠道微生物α多样性指数
α多样性指数反映组间物种丰度及物种多样性的差异。其中Shannon和Simpson指数反映物种多样性,Ace和Chao指数评估物种丰度,Shannon值越大或Simpson值越小,说明群落多样性越高。由表5可知,饲粮中添加金荞麦主要对回肠的物种丰度差异显著(P<0.05),其中T2组的Ace和Chao指数显著低于对照组(P<0.05)。
表5 鲜饲金荞麦对蛋鸡肠道微生物α多样性指数的影响Table 5 Effect of fresh-fed Fagopyrum dibotrys on gut microbial α diversity index in laying hens
2.3 蛋鸡肠道菌群的物种多样性分析
高通量测序表明,蛋鸡回肠和盲肠内容物样品测序共获得2 288 250 对Reads,平均产生 74 112 条Clean tags,得到2 251和2 884个OTU。为更好展现不同金荞麦添加组之间的差异,分别对回肠中2 251个OTU和盲肠中2 884个OTU进行维恩图分析(图1和图2),结果显示,回肠中不同处理组之间共有200个OTU,不同处理组之间独有OTU个数分别为6、65、1、4和14;盲肠中共有499个OTU,独有OTU个数分别为11、10、5、8和8。
图1 回肠微生物多样性维恩分析图Fig.1 Venn diagram analysis of Ileum
图2 盲肠微生物多样性维恩分析图Fig.2 Venn diagram analysis of Cecum
由图3可知,门水平上,回肠微生物中相对丰度前5的细菌门分别为厚壁菌(Firmicutes),各组丰度分别为79.24%、56.26%、75.69%、58.72%、36.02%;蓝细菌(Cyanobacteria),各组丰度分别为1.22%、29.74%、18.65%、26.36%、41.13%;放线菌(Actinobacteria),各组丰度分别为84.40%、4.51%、4.06%、9.94%、6.16%;变形杆菌(Proteobacteria),各组丰度分别为6.23%、1.56%、1.17%、3.80%、9.93%;拟杆菌(Bacteroidetes),各组丰度分别为2.38%、7.54%、0.30%、0.64%、0.48%。
图3 蛋鸡回肠微生物在门水平的组成图Fig.3 Composition of Ileal microorganism in layer at phyla level
由图4可知,盲肠微生物中相对丰度前5的细菌门分别为厚壁菌(Firmicutes),各组丰度分别为52.54%、48.03%、50.35%、46.38%、37.49%; 拟杆菌(Bacteroidetes),各组丰度分别为38.90%、40.39%、40.55%、45.29%、41.44%;放线菌(Actinobacteria),各组丰度分别为5.98%、7.18%、4.67%、2.96%、4.78%;疣微菌(Verrucomicrobia),各组丰度分别为0.21%、0.25%、0.31%、0.24%、12.7%;变形杆菌(Proteobacteria),各组丰度分别为1.18%、1.94%、2.34%、2.42%、1.90%。
图4 蛋鸡盲肠微生物在门水平的组成Fig.4 Composition of Cecal microorganism in layer at phyla level
由图5可知,属水平上,回肠微生物中相对丰度前5的细菌属分别为乳杆菌(Lactobacillus)、未分类细菌(uncultured_bacterium)、未分类真核生物(uncultured_eukaryote)、双歧杆菌(Bifidobacterium)和肠球菌(Enterococcus)。各处理组丰度前5的细菌属分别为C组:72.36%、0.92%、0.31%、1.06%、0.36%;T1组:49.77%、6.97%、23.87%、34.81%、0.17%;T2组:75.29%、19.51%、0.07%、3.28%、0.03%;T3组:48.93%、28.22%、0.02%、6.10%、3.98%;T4组:30.10%、44.22%、0.02%、3.06%、0.83%。
由图6可知,盲肠微生物中相对丰度前5的细菌属分别为拟杆菌(Bacteroides)、理研菌(Rikenellaceae_RC9_gut_group) 、乳杆菌(Lactobacillus)、瘤胃球菌(uncultured_bacterium_f_Ruminococcaceae)、扭链胃球菌([Ruminococcus]_torques_group)。各处理组丰度前5的细菌属分别C组:13.51%、15.98%、12.02%、4.91%、3.15%;T1组:20.95%、11.69%、72.69%、43.48%、43.19%;T2组:17.07%、11.58%、4.50%、3.62%、3.94%;T3组:19.74%、10.99%、1.30%、4.98%、5.93%;T4组:16.66%、13.08%、2.25%、3.93%、4.09%。
图6 蛋鸡盲肠微生物在属水平的组成Fig.6 Composition of Cecal microorganism in layer at genus level
3.1 鲜饲金荞麦对肠道目的基因表达的影响
正常的肠道粘膜屏障功能是畜禽健康与否的重要保障,当高温不断刺激畜禽时,机体会通过下调Occluding和Claudin基因的mRNA表达增加肠粘膜的通透性,损害畜禽肠道粘膜结构,进而导致肠道代谢功能障碍。同时,机体内毒素、病原菌等有害物质通过受损的肠道粘膜释放进入血液,诱发肠炎、败血症及多脏器功能衰竭综合征[13-14]。
目前,某些中草药及其提取物作为抗生素替代品是饲料行业研究热点之一,沈萍等[15]将由藿香、薄荷、知母、红景天等7种中草药组成的方剂添加在高温条件下的蛋鸡饲粮中,发现蛋鸡小肠局部黏膜免疫功能得到改善,肠道上皮淋巴细胞数量和浓度均提高。何邵平[16]报道指出,中草药虎杖提取物白藜芦醇(200～500 mg/kg)能够有效改善高温条件下肉鸡机体代谢,提高肠道紧密连接,抑制炎症反应,提高生产性能。Mei等[17]研究发现,中草药厚朴提取的厚朴酚(20 μmol/L)可缓解热应激造成的小鼠小肠上皮细胞G1期细胞周期阻滞。本试验研究发现,在夏季自然高温条件下蛋鸡饲粮中添加10%～15%的新鲜金荞麦上调了十二指肠和回肠中的Occluding和EGF的基因表达量,表明金荞麦具有提高蛋鸡肠道紧密连接的作用,且改善了肠道受损的修复机能,这与韩芳芳等[18]报道指出的金荞麦提取物上调了猪上皮细胞闭合小环蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)、Occluding的表达,抑制机体炎症反应,保护肠道粘膜的结果类似,可能是由于金荞麦含有黄酮类、多酚类、有机酸类等多重抗氧化活性成分,能显著清除O2-和-OH,增加代谢自由基的酶的活性,缓解蛋鸡因高温造成的氧化应激反应,间接影响了肠道紧密连接蛋白和修复因子的表达[19-20],但具体分子信号通路的作用机制尚需进一步研究。
3.2 鲜饲金荞麦对热应激蛋鸡微生物区系的影响
研究发现,家禽的肠道屏障有四个,主要包括机械屏障、化学屏障、免疫屏障和微生物屏障,四个屏障之间相互关联、共同维护家禽肠道健康[21]。其中肠道微生物不仅参与肠道中大部分的新陈代谢活动,同时可以在肠道粘膜表面形成保护层,阻止致病菌侵入机体,因此,肠道微生物对于维持肠道稳态至关重要[22]。当畜禽暴露在高温条件下,肠道微生态平衡遭到破坏,有害微生物开始在肠道上皮细胞黏附、定植,损害家禽肠道屏障[23]。
本试验利用高通量测序技术对不同金荞麦添加剂量中蛋鸡回肠和盲肠微生物多样性进行分析,结果显示,回肠中相对丰度前5的优势细菌门分别为:厚壁菌、蓝细菌、放线菌、变形杆菌和拟杆菌。这与王雪洁[24]报道的回肠主要细菌门类型的结果有所差异,主要表现在蓝细菌门在家禽肠道中鲜见,而哺乳类或其它脊椎动物肠道中却常见[25],可能是由于家禽回肠中菌群定植的种类受动物品种、生存环境影响所致[26]。盲肠中丰度前5的优势细菌门分别为:厚壁菌、拟杆菌、放线菌、疣微菌和变形杆菌。回肠中丰度前5的优势细菌属分别为:乳杆菌、未分类细菌、其他细菌、双歧杆菌和肠球菌;盲肠中分别为:拟杆菌、理研菌、乳杆菌、瘤胃球菌和扭链胃球菌。这与前人报道鸡肠道主要细菌门与细菌属类型的结果基本吻合[27-28]。然而,各处理蛋鸡回肠和盲肠微生物结构和组成存在较大差异,主要表现在试验组蛋鸡肠道中厚壁菌门(36.02%～75.69%)和放线菌门(4.06%～9.94%)的丰度显著低于对照组(79.24%和84.40%),而蓝菌门呈相反趋势;此外,试验因子降低了盲肠中的厚壁菌门丰度,但提高了拟杆菌门丰度,该结果提示新鲜金荞麦作为蛋鸡饲粮组成部分对其肠道优势菌群有较大影响,但这种变化对肠道功能或其它机能的正面或负面作用还需进一步验证。值得注意的是,双歧杆菌属和乳杆菌属作为家禽肠道中的有益菌群[29]也出现了较大差异,蛋鸡回肠中的双歧杆菌属丰度随金荞麦添加水平的提高呈整体上升趋势,但盲肠中的乳杆菌属整体呈先上升后降低的趋势(丰度最高为T2组72.69%),表明金荞麦有利于蛋鸡回肠中双歧杆菌的增殖,而对盲肠中乳杆菌属的增殖有剂量效应,即适宜添加量的新鲜金荞麦有利于蛋鸡盲肠中乳杆菌的增殖,超过10%则会对乳杆菌的增殖有负面作用,不利于病原菌抑制和其它营养物质的消化吸收[30],该效应与本课题前期研究的产蛋率等生产性能结果相吻合[10]。
本试验结果显示,金荞麦作为蛋鸡饲粮的组成部分具有提高肠道紧密连接蛋白基因表达量的作用,同时改变了回肠中细菌门的多样性和盲肠中优势细菌属的丰度,但还不清楚微生物菌群变化与肠道紧密连接蛋白的基因表达的关系,这将成为下一步的研究方向,以进一步揭示金荞麦对蛋鸡抗热应激的作用机制。
鲜饲金荞麦上调了夏季高温条件下蛋鸡十二指肠和回肠中紧密连接蛋白基因Occluding和修复因子基因EGF的表达量;鲜饲金荞麦改变了夏季高温条件下蛋鸡回肠和盲肠细菌门的多样性,促进了双歧杆菌属的増殖,添加量不超过10%时对乳杆菌属的増殖有正向调控作用。
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