陈 璐，周省委，徐可可，张高阳，刘汶泽，曹小凤，杨林林，董诚明
（1.河南中医药大学 药学院，河南 郑州 450046；
2.河南省道地药材生态种植工程技术研究中心，河南 郑州 450046）
冬凌草为唇形科植物碎米桠[Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara]的干燥地上部分。气微香，味苦、甘，微寒，归肺、胃、肝经，其主要活性成分有萜类、甾体、黄酮、挥发油、有机酸等成分，具有抗肿瘤、抗菌消炎、抗氧化、免疫增强等作用[1]。中药药渣是中药制药过程中产生的主要废弃物，每年产量高达数千万吨，其中残留多种有效成分并且仍具有蛋白质、淀粉、多糖等营养物质[2]。前期调研发现，冬凌草药材生产过程中主要提取了冬凌草甲素、冬凌草乙素等活性成分，产生大量以叶为主的药渣，而药渣中还含有未完全提取的齐墩果酸、熊果酸等有效成分及营养物质，但尚未有相关药渣的综合利用研究，这不仅造成了中药资源的浪费，还对环境造成了危害，制约了中药绿色产业经济的健康发展。齐墩果酸又名土当归酸，属五环三萜类化合物，具有抗炎、抗肿瘤、抗糖尿病、抗动脉粥样硬化、保肝、抗骨质疏松等作用[3]；
熊果酸又名乌索酸，属三萜类化合物，具有镇静、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化和保肝等多种药理活性[4]。杨夕鸣等[5]通过研究齐墩果酸和熊果酸的关键分子机制，发现其对肿瘤既有直接抑制作用，也能以调控机体免疫力间接表现抗肿瘤效果。夏禹等[6]研究发现，温莪术药渣再提取后仍含有多种姜黄素类化合物、莪术二酮等活性成分，进行分离纯化后可得到安全有效的抗氧化剂。付亮等[7]水提淫羊藿药渣，发现药渣中含有大量黄酮类物质和少量的多糖，仍具有一定的药效和抗氧化活性。雷茜等[8]研究发现，苦豆子药渣中富含粗蛋白、粗纤维及磷等微量元素，营养价值较高，可二次利用生产蛋白质饲料。酵母菌、乳酸菌、芽孢杆菌等是常用的益生菌[9-11]，诸多研究表明，饲料中添加酵母菌、乳酸菌可以让动物消化吸收得到改善，机体免疫力明显提高[12-16]。因此，酵母菌、乳酸菌经常作为天然的饲料添加剂应用于中药药渣再利用生产中[17]。嗜酸乳杆菌是人类和动物肠道中的一种重要的乳酸菌，具有维持肠道菌群平衡、提高动物生产性能和机体免疫功能等作用，且其耐酸性强，能够利用葡萄糖、果糖、乳糖和蔗糖等进行发酵并产生乳酸等有机酸[18]。固体发酵具有生产成本相对较低、代谢物得到充分保留、储存和运输方便等优点，更适应于生产的要求[19]。向宇[20]采用益生菌组合固体发酵甘草药渣，发现甘草黄酮析出量增多，纤维素酶和酸性蛋白酶活力增加。陈华[21]研究发现，混合菌固体发酵黄芪药渣产生的纤维素酶可有效降解药渣纤维素，促进药渣中黄芪甲苷的析出。戴德慧等[22]的研究结果表明，酵母菌和乳酸菌发酵丹参药渣，可溶性多糖和真蛋白含量增加。因此，探讨中药药渣合理利用途径是节约生态资源、推动畜牧业减抗增效的可行措施之一。
以冬凌草药渣为主要原料，利用IBM SPSS Statistics 26.0 对测定指标进行相关性和主成分分析，综合评价确定适合冬凌草药渣固体发酵的条件，旨在通过酵母菌和乳酸菌固体发酵，降低其中的纤维素含量，促进残留活性成分析出，增加粗蛋白、粗脂肪、钙、粗灰分、赖氨酸含量，提高冬凌草药渣利用率，解决废弃冬凌草药渣大量浪费的问题，为提升中药生态产业，生产绿色、安全的冬凌草药渣微生态添加剂提供参考。
1.1 材料与试剂
冬凌草药渣：河南济世药业有限公司；
酵母菌：酿酒酵母，安琪酵母股份有限公司；
嗜酸乳杆菌：北京北纳创联生物技术研究院；
齐墩果酸标准品、熊果酸标准品均购于上海源叶生物科技有限公司，其他常用化学试剂均为市售分析纯。
1.2 仪器与设备
RTOP-430D智能人工气候培养箱：浙江托普仪器有限公司；
HY-8 调速振荡器：国华电器有限公司；
LDZM-80KCS 型立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；
Agilent 1260 型高效液相色谱仪：美国安捷伦公司。
1.3 方法
1.3.1 样品前处理 将冬凌草药渣打成粉末，过筛，粒度为0.425 mm，保存于干燥器中。
1.3.2 试验方法 酵母菌接种液制备：将转接复活的酵母菌接种在YPD平板培养基上，28 ℃温度条件下培养2 d，挑取单一菌落制备1×108cfu/mL菌悬液，将菌悬液按1%接种量接种在YPD 液体培养基中，28 ℃、160 r/min 培养24 h，得酵母菌接种液。乳酸菌接种液制备：将转接复活的酵母菌接种在MRS平板培养基上，37 ℃温度条件下培养3 d，挑取单一菌落制备1×108cfu/mL 菌悬液，将菌悬液按1%接种量接种在MRS 液体培养基中，37 ℃、100 r/min 培养48 h，得乳酸菌接种液。
取上述接种液1 mL，离心后弃去上清液，将沉淀稀释至1 mL，振荡混匀后使用酶标仪测其OD600值，根据测得OD600值将酵母菌接种液稀释或浓缩至OD600=0.6，乳酸菌接种液稀释或浓缩至OD600=0.5，用于之后接种。
固体发酵方法：称取1.3.1 中冬凌草药渣粉末100 g 置于600 mL 兰花瓶中，加去离子水调整料液比为1∶1.2，灭菌，冷却后接种9%酵母菌或乳酸菌接种液，搅拌均匀，置于28 ℃恒温恒湿条件下静置培养6 d，隔24 h翻料一次，每组设置3个重复。
1.3.3 冬凌草药渣固体发酵培养条件优化
1.3.3.1 接种量对固体发酵的影响 将1.3.2 中的接种液以3%、6%、9%、12%、15%的接种量接种于料液比为1∶1.2 的固体发酵培养基中，在28 ℃温度条件下培养6 d。
1.3.3.2 料液比对固体发酵的影响 将1.3.2 中的接种液以9%的接种量接种在固体发酵培养基中，分别选择1∶0.8、1∶1.0、1∶1.2、1∶1.4、1∶1.6 的料液比，在28 ℃温度条件下培养6 d。
1.3.3.3 时间对固体发酵的影响 将1.3.2 中的接种液以9%的接种量接种于料液比为1∶1.2 的固体发酵培养基中，在28 ℃温度条件下分别培养1、3、6、9、12 d。
1.3.3.4 温度对固体发酵的影响 将1.3.2 中的接种液以9%的接种量接种于料液比为1:1.2的固体发酵培养基中，酵母菌分别在25、28、31、34、37 ℃的温度条件下发酵6 d，乳酸菌分别在23、28、33、38、42 ℃的温度条件下发酵6 d。
1.3.4 测定方法 粗蛋白含量测定方法：采用凯氏法，参照《饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法》（GB/T 6432—2018）；
粗纤维含量测定方法：采用过滤法，参照《饲料中粗纤维的含量测定方法》（GB/T 6434—2006）；
粗脂肪含量测定方法：参照《饲料中粗脂肪的测定》（GB/T 6433—2006）；
钙含量的测定方法：采用乙二胺四乙酸二钠络合滴定法，参照《饲料中钙的测定》（GB/T 6436—2018）；
粗灰分含量的测定方法：参照《饲料中粗灰分的测定》（GB/T 6438—2007）；
赖氨酸含量的测定方法：采用常规酸水解法，参照《饲料中氨基酸的测定》（GB/T 18246—2019）。冬凌草药渣齐墩果酸、熊果酸含量的测定参考崔田[23]的方法略有改动，色谱柱:安捷伦ZORBAX SB-Cl8 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；
柱温:30 ℃；
流动相:甲醇-0.2% 醋酸溶液（88∶12）；
流速:1.0 mL/min；
检测波长:210 nm；
进样量10 μL；
采用外标法进行定量。
1.4 数据与处理
用Excel 2022 整理数据，利用IBM SPSS Statistics 26.0 软件进行Pearson 相关性分析和主成分分析，利用GraphPad Prism 9 软件处理数据并作图，利用ChiPlot 工具在https://www.chiplot.online 作组间相关性分析热图。
2.1 接种量对固体发酵的影响
2.1.1 酵母菌接种量对固体发酵的影响 从图1可以看出，加入不同接种量酵母菌接种液后，粗蛋白含量整体呈缓慢上升趋势，15%接种量时粗蛋白含量最高，比原药渣增加0.62%；
粗纤维含量变化呈W形，12%接种量时粗纤维含量最低，比原药渣减少21.70%；
粗脂肪含量先下降后升高再呈下降趋势，3% 接种量时粗脂肪含量最高，比原药渣减少30.77%；
钙含量先升高后下降再升高，15%接种量时钙含量最高，比原药渣增加5.56%；
粗灰分含量先下降后呈缓慢上升趋势，3%接种量时粗灰分含量最高，比原药渣增加10.53%；
赖氨酸含量整体呈缓慢上升趋势，15%接种量时赖氨酸含量最高。从表1 可以看出，酵母菌6%接种量时，熊果酸含量最高，为0.38 mg/g，比原药渣增加2.70%，此时齐墩果酸含量为0.20 mg/g；
酵母菌15%接种量时，齐墩果酸含量最高为0.21 mg/g，比原药渣增加5.00%，此时熊果酸含量为0.36 mg/g。
表1 酵母菌接种量对冬凌草药渣中齐墩果酸及熊果酸含量的影响Tab.1 Effect of inoculation amount of yeast on the content of oleanolic acid and ursolic acid in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara
图1 不同接种量对冬凌草药渣各产物的影响Fig.1 Effect of different inoculation amount on the products in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara
2.1.2 乳酸菌接种量对固体发酵的影响 从图1可以看出，加入不同接种量乳酸菌接种液后，粗蛋白含量先下降后缓慢升高，3%接种量时粗蛋白含量最高，比原药渣增加14.14%；
粗纤维含量先下降后升高，6%接种量时粗纤维含量最低，比原药渣减少17.22%；
粗脂肪含量先下降后升高，12%接种量时粗脂肪含量最高，比原药渣减少15.38%；
钙含量变化呈M 形降低，6%接种量时钙含量最高，比原药渣增加44.44%；
粗灰分含量先下降后趋于稳定，9%接种量时粗灰分含量最高，比原药渣增加25.00%；
赖氨酸含量先下降后升高再下降，3%接种量时赖氨酸含量最高，比原药渣增加6.06%。从表2 可以看出，乳酸菌接种量的改变对齐墩果酸和熊果酸含量的提升没有太大效果。
表2 乳酸菌接种量对冬凌草药渣中齐墩果酸及熊果酸含量的影响Tab.2 Effect of inoculation amount of lactic acid bacteria on the content of oleanolic acid and ursolic acid in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara
2.2 料液比对固体发酵的影响
2.2.1 酵母菌料液比对固体发酵的影响 从图2可以看出，酵母菌料液比变化对冬凌草药渣固体发酵检测产物钙含量、粗灰分含量、赖氨酸含量的影响不大。酵母菌发酵，料液比变化时，粗蛋白含量缓慢降低，料液比1∶0.8 时粗蛋白含量最高，比原药渣增加23.32%；
粗纤维含量先下降后缓慢升高，料液比1∶1 时粗纤维含量最低，比原药渣减少26.65%；
粗脂肪含量随着发酵中含水量的增加缓慢降低，料液比1∶0.8 时粗脂肪含量最高，比原药渣减少15.38%。从表3 可以看出，酵母菌发酵，料液比1∶1.0 时间时熊果酸含量最高，为0.45 mg/g，比原药渣增加21.62%，此时齐墩果酸含量为0.22 mg/g；
料液比1∶1.2 时齐墩果酸含量最高，比原药渣增加20.00%，此时熊果酸含量为0.42 mg/g。
表3 酵母菌料液比对冬凌草药渣中齐墩果酸及熊果酸含量的影响Tab.3 Effect of yeast material-liquid ratio on the content of oleanolic acid and ursolic acid in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara
图2 不同料液比对冬凌草药渣各产物的影响Fig.2 Effect of different ratio of material to liquid on the products in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara
2.2.2 乳酸菌料液比对固体发酵的影响 从图2可以看出，乳酸菌发酵料液比变化时，粗蛋白含量整体呈下降趋势，料液比1∶0.8 时粗蛋白含量最高，比原药渣增加36.22%；
粗纤维含量先下降后缓慢升高，料液比1∶1.0 时粗纤维含量最低，比原药渣减少26.65%；
粗脂肪含量先升高后下降，料液比1∶1.4 时粗脂肪含量最高，比原药渣增加46.15%。从表4 可以看出，乳酸菌发酵，料液比1∶0.8 时齐墩果酸和熊果酸含量最高，比原药渣增加10.00%、18.92%。
表4 乳酸菌料液比对冬凌草药渣中齐墩果酸及熊果酸含量的影响Tab.4 Effect of material-liquid ratio of lactic acid bacteria on the content of oleanolic acid and ursolic acid in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara
2.3 发酵时间对固体发酵的影响
2.3.1 酵母菌发酵时间对固体发酵的影响 从图3
图3 不同固体发酵时间对冬凌草药渣各产物的影响Fig.3 Effect of different solid fermentation time on the products in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara
可以看出，酵母菌发酵后，粗蛋白含量先下降后呈上升趋势，在发酵1 d 时含量最高，比原药渣增加9.39%；
粗纤维含量变化呈N 形，在发酵9 d 时含量最低，比原药渣减少12.26%；
粗脂肪含量先升高并在发酵3 d 后趋于稳定，在发酵3 d 时含量最高，比原药渣增加23.07%；
钙含量先下降后升高，在发酵9 d 时含量最高，比原药渣增加31.48%；
粗灰分含量先升高后下降，在发酵3 d 时含量最高，比原药渣增加19.74%；
赖氨酸含量随着发酵时间逐步升高，在发酵9 d 时含量最高，比原药渣增加6.06%。从表5可以看出，酵母菌发酵3 d，齐墩果酸及熊果酸含量最高，比原药渣增加15.00%、16.22%。
表5 酵母菌固体发酵时间对冬凌草药渣中齐墩果酸及熊果酸含量的影响Tab.5 Effect of solid fermentation time of yeast on the content of oleanolic acid and ursolic acid in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara
2.3.2 乳酸菌发酵时间对固体发酵的影响 从图3可以看出，乳酸菌发酵后，粗蛋白含量先下降后升高，在发酵9 d时含量最高，比原药渣增加9.39%；
粗纤维含量先下降后缓慢升高，在发酵3 d 时含量最低，比原药渣减少7.78%；
粗脂肪含量随着发酵时间缓慢升高，在发酵9 d 时含量最高，比原药渣增加38.46%；
钙含量先下降后升高，在发酵12 d 时含量最高，比原药渣增加37.04%；
粗灰分含量先降低后呈上升趋势，在发酵12 d 时含量最高，比原药渣增加15.79%；
赖氨酸含量先下降后缓慢上升，在发酵12 d时含量最高，比原药渣增加3.03%。从表6可以看出，乳酸菌发酵1 d，齐墩果酸及熊果酸含量最高，比原药渣增加15.00%、18.92%。
表6 乳酸菌固体发酵时间对冬凌草药渣中齐墩果酸及熊果酸含量的影响Tab.6 Effect of solid fermentation time of lactic acid bacteria on the content of oleanolic acid and ursolic acid in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara
2.4 温度对固体发酵的影响
2.4.1 酵母菌发酵温度对固体发酵的影响 从图4可以看出，酵母菌发酵温度变化时，粗蛋白含量整体呈上升趋势，发酵温度37 ℃粗蛋白含量最高，比原药渣增加9.60%；
粗纤维含量先下降后上升再下降，发酵温度27 ℃粗纤维含量最低，比原药渣减少13.68%；
粗脂肪含量先下降后升高，发酵温度37 ℃粗脂肪含量最高为1.30%；
钙含量先下降后升高，发酵温度37 ℃钙含量最高，比原药渣增加29.63%；
粗灰分含量整体呈上升趋势，发酵温度37 ℃粗灰分含量最高，比原药渣增加17.11%；
赖氨酸含量整体呈上升趋势，发酵温度37 ℃赖氨酸含量最高，比原药渣增加12.12%。从表7 可以看出，酵母菌发酵温度25 ℃时，齐墩果酸和熊果酸含量最高，比原药渣增加10.00%、8.10%。
表7 酵母菌固体发酵温度对冬凌草药渣中齐墩果酸及熊果酸含量的影响Tab.7 Effect of solid fermentation temperature of yeast on the content of oleanolic acid and ursolic acid in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara
图4 不同固体发酵温度对冬凌草药渣中各产物的影响Fig.4 Effects of different solid fermentation temperatures on the products in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara
2.4.2 乳酸菌发酵温度对固体发酵的影响 从图4可以看出，乳酸菌发酵温度变化时，粗蛋白含量、粗纤维含量、钙含量、粗灰分含量变化不大，粗脂肪含量先升高后降低，发酵温度28 ℃粗脂肪含量最高，比原药渣增加46.15%；
赖氨酸含量先下降后趋于稳定，发酵温度23 ℃赖氨酸含量最高，比原药渣增加21.21%。从表8 可以看出，乳酸菌发酵温度变化对齐墩果酸和熊果酸含量增加没有显著效果。
表8 乳酸菌固体发酵温度对冬凌草药渣中齐墩果酸及熊果酸含量的影响Tab.8 Effect of solid fermentation temperature of lactic acid bacteria on the content of oleanolic acid and ursolic acid in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara
2.5 酵母菌和乳酸菌固体发酵冬凌草药渣产物相关性分析
2.5.1 酵母菌固体发酵冬凌草药渣产物相关性分析 采用IBM SPSS Statistics 26.0 对酵母菌发酵冬凌草药渣不同检测产物进行组内Pearson 相关性分析，结果如图5所示，齐墩果酸与粗脂肪相关性达到0.45 呈显著正相关，与熊果酸相关性达到0.86 极显著正相关；
粗蛋白与钙、粗灰分、赖氨酸相关性分别达到0.95、0.97、0.90 呈极显著正相关，与粗纤维相关性达到-0.87 呈极显著负相关；
粗纤维与钙、粗灰分、赖氨酸相关性分别达到-0.90、-0.91、-0.76 呈极显著负相关；
钙与粗灰分、赖氨酸相关性分别达到0.96、0.84 呈极显著正相关；
粗灰分与赖氨酸相关性达到0.87呈极显著正相关。
图5 酵母菌发酵冬凌草药渣各产物的相关性Fig.5 Correlation of yeast fermentation products in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara
2.5.2 乳酸菌固体发酵冬凌草药渣产物相关性分析 采用IBM SPSS Statistics 26.0 对乳酸菌发酵冬凌草药渣不同检测产物进行组内Pearson 相关性分析，结果如图6所示，齐墩果酸与熊果酸相关性达到0.89，呈极显著正相关；
熊果酸与粗蛋白相关性达到0.53，呈显著正相关；
粗蛋白与钙相关性达到0.46，呈显著正相关，与赖氨酸相关性达到0.77，呈极显著正相关；
粗脂肪与钙、粗灰分相关性分别达到0.56、0.57，呈极显著正相关；
钙与粗灰分相关性达到0.46，呈显著正相关，与赖氨酸相关性达到0.68，呈极显著正相关。
图6 乳酸菌发酵冬凌草药渣各产物的相关性Fig.6 Correlation of lactic acid bacteria fermentation products in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara
2.6 酵母菌和乳酸菌固体发酵冬凌草药渣产物主成分分析
2.6.1 酵母菌固体发酵冬凌草药渣产物主成分分析 由表9 可知，8 个理化指标因子可形成3 个主成分，3 个主成分的累计方差贡献率为82.624%，涵盖了大于总体信息的80%，符合分析要求，可依次进行主成分分析，综合评价冬凌草药渣产物。将各指标变量的主成分载荷除以主成分相对应的特征值平方根得到标准化变量的系数向量，依此列出主成分解析表达式：
表9 酵母菌固体发酵冬凌草药渣产物的载荷矩阵Tab.9 Load matrix of products of residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara by solid fermentation of yeast
F3=0.616X1+0.489X2-0.214X3+0.190X4+0.142X5-0.185X6-0.182X7-0.460X8。
根据各指标成分在每个主成分中的提取贡献度进行标准化处理，计算每个主成分的得分。根据主成分F1、F2、F3在累计值中的占比，计算各处理的总得分F，排序比较。
从表10 可以看出，酵母菌固体发酵各处理中，处理12 得分最高。处理12（接种量6%、料液比1∶1.2、发酵时间3 d、发酵温度28 ℃）粗蛋白含量相较于发酵前提高0.93%，粗纤维含量相较于发酵前减少1.19%，粗脂肪含量相较于发酵前提高23.08%，钙含量相较于发酵前提高13.89%，齐墩果酸含量相较于发酵前提高15.00%，熊果酸含量较发酵前提高16.22%。
表10 酵母菌固体发酵冬凌草药渣各处理的评价分值Tab.10 Evaluation score of each treatment of residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara by solid fermentation of yeast
2.6.2 乳酸菌固体发酵冬凌草药渣产物主成分分析 由表11 可知，8 个理化指标因子可形成2 个主成分，2 个主成分的累计方差贡献率为84.582%，涵盖了大于总体信息的80%，符合分析要求，可依次进行主成分分析，综合评价冬凌草药渣产物。将各指标变量的主成分载荷除以主成分相对应的特征值平方根得到标准化变量的系数向量，依此列出主成分解析表达式：
表11 乳酸菌固体发酵冬凌草药渣检测产物的载荷矩阵Tab.11 Load matrix of products of residue of（Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara by solid fermentation of lactic acid bacteria
F1=0.115X1+0.033X2+0.456X3-0.425X4+0.121X5+0.447X6+0.454X7+0.420X8；
F2=0.643X1+0.650X2+0.015X3+0.089X4+0.422X5-0.100X6-0.082X7-0.083X8。
根据各指标成分在每个主成分中的提取贡献度进行标准化处理，计算每个主成分的得分。根据主成分F1、F2在累计值中的占比，计算各处理的总得分F，排序比较。
从表12 可以看出，乳酸菌固体发酵各处理中，处理8得分最高。处理8（接种量6%、料液比1∶1.2、发酵时间6 d、发酵温度28 ℃）粗蛋白含量较发酵前提高33.02%，粗纤维含量相较于发酵前减少24.76%，粗脂肪含量相较于发酵前提高23.08%，钙含量相较于发酵前提高了74.07%，赖氨酸含量相较于发酵前提高21.21%。
表12 乳酸菌发酵冬凌草药渣各处理的评价分值Tab.12 Evaluation score of each treatment of residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara by solid fermentation of lactic acid bacteria
冬凌草药渣为工业生产提取冬凌草甲素、冬凌草乙素后剩余的残渣，目前工业生产提取方式较为单一，经提取后的药渣中仍含有大量的有效成分。齐墩果酸和熊果酸作为冬凌草药渣中的两种重要药用活性成分，是其发挥药效的物质基础[1]，可以帮助禽畜动物增强抵抗力，提高抗炎能力，预防肿瘤的形成[24]。粗蛋白、粗纤维、粗脂肪、钙、粗灰分、赖氨酸等是评价饲料营养价值常用的指标[25]。冬凌草药渣中的粗纤维可能是一种抗营养因子，因此，要降低其含量[26]。酵母菌作为酶、优质蛋白质、游离核苷酸、B族维生素和氨基酸的丰富来源，广泛应用于饲料生产中，同时作为生长刺激剂取代抗生素，有效克服了使用抗生素所产生的耐药性、药物残留等一系列问题，具有巨大的益生潜力[27]。乳酸菌具有抗菌、维持肠道菌群平衡、促进营养物质消化吸收、刺激或诱导机体免疫系统、提高动物免疫力等生理功能[28]。因此，本研究分别用酵母菌、乳酸菌作为单一发酵菌株，对冬凌草药渣进行固体发酵，并优化发酵工艺，将药渣中动物不能直接利用的纤维素降解，提高冬凌草药渣中齐墩果酸和熊果酸等活性物质的含量。发酵后的冬凌草药渣可用作一种具有高价值的饲料资源，不仅能缓解畜牧饲料资源紧张的问题，也能解决废弃冬凌草药渣对周围环境造成污染的问题，为生产天然、安全的冬凌草微生态添加剂提供技术支撑。本研究通过单因素条件优化，对数据进行相关性和主成分分析，最终筛选出适合酵母菌固体发酵冬凌草药渣的最优条件为接种量6%、料液比1∶1.2、发酵天数3 d、发酵温度28 ℃，以此方法发酵冬凌草药渣后齐墩果酸、熊果酸含量均较发酵前显著提高，这可能是由于酵母菌可以有效提高合成齐墩果酸和熊果酸的前体α-香树脂醇和β-香树脂醇[29]，其确切机制还需要进一步研究。粗脂肪较发酵前显著提高，这与王雪涛[30]和裴丽鹏[31]的研究结果相似，粗蛋白含量较发酵前提高，但没有显著性差异，粗纤维含量较发酵前减少，但没有显著性差异，关于延长酵母菌发酵时间和增加酵母菌接种量是否能继续提高粗蛋白含量或减少粗纤维含量，有待进一步探讨。适合乳酸菌固体发酵冬凌草药渣的最优条件为接种量6%、料液比1∶1.2、发酵天数6 d、发酵温度28 ℃，以此方法发酵冬凌草药渣后齐墩果酸、熊果酸含量没有显著变化。甘奕[32]研究发现，乳酸菌发酵山楂液后游离氨基酸显著增加，齐墩果酸含量显著降低，本试验与上述研究结果一致，这表明乳酸菌可能抑制了齐墩果酸和熊果酸的析出。但乳酸菌发酵后粗蛋白、粗脂肪、赖氨酸含量均较发酵前显著提高，粗纤维含量较发酵前显著降低，这与吴鹏涛等[33]的研究结果相似，表明乳酸菌可以有效降解冬凌草药渣中的纤维素，并在一定程度上增加了粗蛋白、粗脂肪等活性成分的含量。本研究中，酵母菌和乳酸菌固体发酵后的冬凌草药渣，其钙、粗灰分含量均有所提高，这可能是发酵过程中冬凌草药渣中的有机物被酵母菌和乳酸菌消耗，导致这些无机物含量的增加[34]，乳酸菌发酵后钙含量的显著增加可能是由于乳酸菌促进冬凌草药渣中的大分子转化为小分子，富集钙离子[35]。综上所述，冬凌草药渣经酵母菌或乳酸菌发酵后，营养价值得到提高，可以添加到动物日粮中，提高动物的免疫力和生长性能。
本研究仅对冬凌草药渣进行了酵母菌或乳酸菌单一菌种发酵，下一步可以考虑酵母菌和乳酸菌或其他菌种混合以不同比例发酵，进一步探究混合菌固体发酵对冬凌草药渣的影响，解决乳酸菌发酵对冬凌草药渣中齐墩果酸、熊果酸含量提升不明显的问题，为冬凌草药渣制备饲料添加剂的研究与开发提供技术支撑。
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