陈二虎，袁国庆，陈艳，陈梦秋，孙晟源，唐培安
线粒体编码基因、和参与锈赤扁谷盗磷化氢抗性形成
陈二虎，袁国庆，陈艳，陈梦秋，孙晟源，唐培安
南京财经大学食品科学与工程学院/江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心/江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室，南京 210023
【背景】锈赤扁谷盗（）是重要储粮害虫，其对磷化氢（phosphine）抗性问题尤为突出。线粒体是生物体的重要细胞器，是昆虫进行呼吸代谢反应的核心场所，其中线粒体编码基因参与调节昆虫呼吸速率、能量代谢以及细胞信号转导等生理过程。【目的】明确线粒体编码基因在锈赤扁谷盗磷化氢抗性形成过程中的作用。【方法】通过CO2检测仪测定锈赤扁谷盗不同磷化氢抗性种群试虫的呼吸速率；
利用RT-qPCR技术解析线粒体编码基因在磷化氢抗性水平和呼吸速率均差异最大的锈赤扁谷盗太仓和上海种群试虫中的表达模式，并进行线粒体复合体I和V的活性测定；
通过RT-qPCR技术研究关键线粒体编码基因和对磷化氢胁迫响应的表达模式以及胁迫后线粒体复合体I和V的活性变化。利用RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术沉默锈赤扁谷盗线粒体编码基因和，同时分析上述基因被有效沉默后试虫呼吸速率和磷化氢敏感性变化情况。【结果】锈赤扁谷盗呼吸速率与磷化氢抗性水平呈负相关关系，即害虫呼吸速率均随磷化氢抗性倍数增加而显著下降。RT-qPCR结果表明线粒体编码基因在锈赤扁谷盗磷化氢极高抗种群（太仓种群，RR=1 906.8）表达量显著低于相对敏感种群（上海种群，RR=1.4），且线粒体复合体I和V的酶活性与线粒体基因表达模式相一致。锈赤扁谷盗经磷化氢熏蒸胁迫后，关键线粒体编码基因和被显著抑制，线粒体复合体I和V的酶活性均显著降低。注射dsRNA有效沉默关键线粒体编码基因和后，锈赤扁谷盗呼吸速率显著降低，磷化氢敏感性显著下降。【结论】线粒体编码基因参与锈赤扁谷盗磷化氢抗性形成。
锈赤扁谷盗；
储粮害虫；
磷化氢抗性；
线粒体；
RNA干扰
【研究意义】锈赤扁谷盗（）是世界范围内危害最严重的储粮害虫之一，其一旦局部暴发便可在粮食储运过程中引发严重的经济损失[1-4]。磷化氢（PH3）作为一种高活性的小分子气体熏蒸剂，具备使用成本低、穿透性强、杀虫效果好、残留低等优点，已成为使用最为广泛的储粮熏蒸剂[5-6]。然而，由于粮食仓储行业对磷化氢的长期依赖以及磷化氢熏蒸的频繁使用导致包括赤拟谷盗（）、谷蠹（）、玉米象（）等多种害虫对磷化氢产生抗性[6-9]。其中锈赤扁谷盗磷化氢抗性问题尤为突出，该害虫磷化氢抗性发展速度及对磷化氢的耐受能力均高于其他储粮害虫[10-12]。鉴于目前尚未发现能有效替代磷化氢的熏蒸剂，为避免和延缓磷化氢抗性的进一步发展，磷化氢抗性机制的研究尤为重要[13]。【前人研究进展】当前，储粮害虫磷化氢抗性形成机制研究主要集中于解毒代谢、表皮穿透和靶标抗性方面。谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase）、细胞色素P450、羧酸酯酶（carboxylesterase）等解毒代谢相关基因在抗性害虫中显著高表达或可被磷化氢诱导表达。通过RNAi技术有效沉默赤拟谷盗和，可显著提高对磷化氢的敏感性，表明解毒代谢反应在昆虫对磷化氢抗性形成中起着关键作用[14-16]。另外，研究发现众多表皮相关基因在储粮害虫磷化氢抗性品系中显著高表达，有效沉默上述关键表皮蛋白基因后，试虫磷化氢抗性水平显著下降[17-18]。磷化氢在昆虫体内的靶标位点是线粒体，药剂通过降低线粒体膜电位，显著提升虫体内活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，从而引起氧化损伤，最终致使害虫死亡。研究发现昆虫线粒体重要的二聚体酶基因——二氢硫辛酰胺脱氢酶（dihydrolipoamide dehydrogenase，DLD）基因的突变介导了昆虫对磷化氢高抗性[19-20]。昆虫线粒体基因组编码了共13种蛋白质亚基，包括7种NADH脱氢酶亚基（和）、1种细胞色素b（）、3种细胞色素c氧化酶亚基（和）以及2种Atp合成酶亚基（和）[21]。【本研究切入点】线粒体编码基因转录水平的变化与昆虫生长发育、药剂抗性、极端温度等环境适应性间存在着密切关联[22-23]，然而其是否参与磷化氢抗性形成尚属未知。【拟解决的关键问题】阐释线粒体编码基因在锈赤扁谷盗磷化氢抗性形成中的重要作用，为解决粮食仓储行业的磷化氢抗性问题打下理论基础。
试验于2021年1月至2023年10月在南京财经大学食品科学与工程学院储粮害虫防治实验室完成。
1.1 供试昆虫
根据联合国粮农组织FAO推荐值并依据其抗性调查数据，确定锈赤扁谷盗敏感品系致死中浓度（LC50）为0.011 mg·L-1，其中昆虫抗性倍数（RR）=测定品系的LC50/敏感品系的LC50，且抗性倍数1—5倍为无抗性或敏感；
5—10倍为低抗性；
10—40倍为中等抗性；
40—160倍为高抗性；
160倍以上则属于极高抗性。供试4个地理种群锈赤扁谷盗分别采自上海（Shanghai，SH）、湘阴（Xiangyin，XY）、怀化（Huaihua，HH）和太仓（Taicang，TC），磷化氢抗性倍数分别为1.4（LC50=0.0154 mg·L-1，低抗性）、29.6（LC50=0.3256 mg·L-1，中等抗性）、362.7（LC50=3.9897 mg·L-1，极高抗性）和1 906.8（LC50=20.9748 mg·L-1，极高抗性）。上述试虫均在实验室内连续饲养20代以上，饲养环境为恒温（30±1）℃、相对湿度（75±5）%、无光照。
1.2 呼吸速率测定
挑选不同储粮害虫2周龄成虫10头，置于50 ml的玻璃虫室中，确保其气密性，在恒温30 ℃、相对湿度（75±5）%、无光照的环境下使用便携式CO2检测仪（B1010，深圳市沃赛特科技有限公司）监测密闭虫室内的CO2含量，杯口配置一个刚好适合且厚度约为8 mm橡皮塞，橡皮塞上扎一小孔，将CO2探测器伸入虫室，并在橡皮塞与杯口的交接处绕上封口膜，每组生物学重复的测量时间为30 min，每隔3 min记录一次数据，重复3次，试虫放入气室后需要10 min左右才能进入稳定的呼吸状态。呼吸速率：以每头试虫每分钟释放的CO2（μL·L-1·min-1）表示[24]。共设置3次生物学重复。
1.3 线粒体编码基因表达量测定
为了分析锈赤扁谷盗太仓种群（极高抗性）和上海种群（低抗性）的线粒体编码基因表达模式，选取上述2个地理种群30头2周龄的成虫作为样本。使用Trizol法提取样本的总RNA（浓度500—600 ng·μl-1），并用RQ1 RNase-Free DNase去除基因组DNA。然后，通过核酸浓度测定仪检测RNA的浓度和纯度，并使用1%琼脂糖凝胶电泳来评估RNA的完整性。利用HiScript® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）（南京诺唯赞生物科技有限公司，中国）从样本中合成第一链cDNA，随后将获得的目标产物保存于-20 ℃冰箱。
基于锈赤扁谷盗完整的线粒体基因组（GenBank登录号：MH475917），获得13个线粒体编码基因的序列[25]，使用Primer Premier软件设计用于RT-qPCR的特异性引物（表1）。以和作为内参基因[26]。使用ChamQTMSYBR® qPCR Master Mix（Low Rox Premixed）712试剂盒和ABI 7500 PCR系统（Applied Biosystems，USA）进行RT-qPCR反应，以分析线粒体编码基因的相对表达量。每个样品设置3次生物学重复和3次技术性重复，使用2-∆∆CT方法对数据进行定量分析[27]。
1.4 线粒体复合体活性检测
选取锈赤扁谷盗太仓种群（极高抗性）和上海种群（低抗性）试虫进行线粒体复合体活性测定。将30头2周龄锈赤扁谷盗成虫加入1.5 ml匀浆介质（0.9%的生理盐水）中，使用组织研磨仪以25 Hz的条件研磨组织样本5 min。随后，样本以6 000 r/min的速度离心10—15 min，以分离上清液。然后，采用BCA方法测定上清液中总蛋白的含量。线粒体复合体I和V的活性通过南京建成生物工程研究所生产的线粒体呼吸链复合物I试剂盒（A089-1-1）和线粒体呼吸链复合物V试剂盒（A089-5-1）进行检测。依据官网（http://www.njjcbio.com）公布的详细操作说明完成试验。共设置3次生物学重复，每个重复均包含30头锈赤扁谷盗试虫。
1.5 磷化氢胁迫下线粒体基因表达量和复合体活性测定
选取锈赤扁谷盗上海种群2周龄成虫开展磷化氢胁迫试验。参照联合国粮农组织（1975）推荐的方法，将50头试虫放入熏蒸瓶中，用凡士林把熏蒸瓶与玻璃旋塞密封，使用磷化氢气体检测仪（MS400-PH3，北京佳粮科贸有限公司，中国）检测磷化氢浓度，使用气密性注射器（Hamilton 7000，北京英伟达科技有限公司，中国）抽取所需浓度的磷化氢气体（LC30=0.0122 mg·L-1作为磷化氢熏蒸浓度）注入熏蒸瓶摇匀，用烛油密闭注射孔，放入温度（30±1）℃、相对湿度（75±5）%的培养箱中，熏蒸处理12 h后快速挑取存活的试虫进行后续试验。随后，为与检测的线粒体复合体相对应，从锈赤扁谷盗13个线粒体基因中选取编码线粒体复合体I的关键基因、和编码线粒体复合体V的关键基因进行后续基因表达模式和RNA干扰的功能研究。参照1.3节方法进行总RNA提取、cDNA合成和RT-qPCR试验，参照1.4节进行线粒体复合体I和V活性检测。共设置3个生物学重复，每个重复均包含50头试虫。
表1 本研究RT-qPCR所用引物序列
1.6 线粒体基因沉默后试虫磷化氢敏感性和呼吸速率检测
选取3个线粒体编码基因、和进行功能验证，使用Primer Premier软件设计双链RNA（dsRNA）片段的合成引物（表2），引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。dsRNA的合成利用Promega公司的T7 RiboMAXTMExpress RNA试剂盒完成，dsRNA引物和所得产物均通过1%琼脂糖凝胶电泳进行验证。参照HUANG等[15]的方法，将约300 ng（浓度约1 000 ng·μL-1，体积为300 nL）dsRNA注射到锈赤扁谷盗（上海种群）蛹内（注射位置为蛹的腹侧第1节或第2节），注射RNase-free water（南京诺唯赞生物技术有限公司，中国）视为空白对照，注射ds视为阴性对照。注射后，将试虫放入培养箱中正常饲养，取2周龄成虫并参照1.3节的方法进行基因的沉默效率检测。最后，、和被沉默后，参照1.2节方法进行锈赤扁谷盗呼吸速率变化检测；
参照联合国粮农组织（1975）推荐的方法进行磷化氢敏感性变化的检测，选取2周龄成虫，并以磷化氢的亚致死浓度（LC30= 0.0122 mg·L-1）对试虫进行处理（密闭熏蒸20 h），待气体散去后统计试虫死亡数量，连续统计14 d（毛笔轻触虫体尾部，附肢无反应即为死亡）。上述试验均设置3次生物学重复，每次重复均包含30头锈赤扁谷盗试虫。
表2 本研究所用dsRNA引物序列
1.7 数据统计与分析
使用SPSS 26.0分析试验数据，两组以上的数据采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行均值多重比较，并利用图基检验法（Tukey’s test）进行显著性分析（＜0.05）。两组数据采用独立样本检验进行差异显著性分析（*＜0.05，**＜0.01，***＜0.001）。采用Origin 2021作图。
2.1 不同磷化氢抗性种群试虫的呼吸速率
4个磷化氢抗性种群锈赤扁谷盗（SH、XY、HH和TC）的呼吸速率见图1。结果显示，不同磷化氢抗性种群锈赤扁谷盗呼吸速率均与磷化氢抗性倍数呈负相关关系，锈赤扁谷盗TC种群（RR=1 906.8）和HH种群（RR=362.7）试虫的呼吸速率显著低于XY种群（RR=29.6）和SH种群（RR=1.4）。
图中数据为平均值±标准差，柱上标有不同小写字母表示样品间差异显著（P＜0.05，Tukey’s test）Data are mean±SD, and different lowercases on the bars indicate the significant difference among samples (P＜0.05, Tukey’s test)。图6—图8同The same as Fig. 6-Fig. 8
2.2 线粒体编码基因在锈赤扁谷盗不同磷化氢抗性种群中的表达模式
13个线粒体编码基因的表达水平在低抗种群（SH）和极高抗种群（TC）试虫中均存在显著差异（＜0.01），且在SH种群试虫的表达量显著高于TC种群。SH种群锈赤扁谷盗线粒体编码基因和的表达量分别为TC种群的1.76、1.82、1.63、1.78、2.40、1.93、1.81、1.81、1.92、1.90、1.73、1.93和1.97倍（图2）。
2.3 不同磷化氢抗性种群试虫的线粒体复合体活性
线粒体复合体I和V活性在锈赤扁谷盗磷化氢低抗种群（SH）和极高抗种群（TC）试虫中的变化如图3所示，两个种群试虫的线粒体复合体I（图3-A）和V（图3-B）的活性之间均存在显著差异（＜0.01），SH种群锈赤扁谷盗线粒体复合体I和V的活性分别为TC种群的1.95和1.83倍。
2.4 磷化氢胁迫下锈赤扁谷盗线粒体编码基因的表达水平
测定了锈赤扁谷盗SH种群试虫经LC30浓度磷化氢熏蒸胁迫12 h后，关键线粒体编码基因和的表达水平变化（图4）。结果显示，经磷化氢熏蒸胁迫后和表达水平显著下调（＜0.05），分别降低47.00%、33.00%和73.00%。
图中数据为平均值±标准差，采用独立样本t检验分析差异显著性Data are mean±SD, and independent sample t test was used to analyze the significance of the difference (* P＜0.05, ** P＜0.01, *** P＜0.001)。图3—图5同The same as Fig. 3-Fig. 5
图3 锈赤扁谷盗TC和SH种群试虫线粒体复合体活性差异
A: Nad5; B: Nad6; C: Atp6
2.5 磷化氢胁迫下锈赤扁谷盗线粒体复合体活性
锈赤扁谷盗SH种群试虫经LC30浓度磷化氢熏蒸胁迫12 h后，线粒体复合体I和V的活性变化如图5所示，经磷化氢熏蒸胁迫后，线粒体复合体I和V的活性显著降低（＜0.001），分别降低68.46%（图5-A）和68.81%（图5-B）。
图5 磷化氢胁迫下锈赤扁谷盗线粒体复合体活性变化
2.6 注射dsRNA后线粒体编码基因的表达水平变化
锈赤扁谷盗SH种群试虫注射特异性dsds和ds后，目标线粒体编码基因的表达水平变化如图6所示，阴性对照组（ds）目标基因表达水平与空白对照组（RNase-free water）相比无显著差异，处理组目标线粒体编码基因被有效沉默，表达水平与阴性对照组相比呈显著下调（＜0.05），基因沉默效率分别达到56.6%（图6-A）、60.7%（图6-B）和57.4%（图6-C）。
2.7 RNA干扰后锈赤扁谷盗呼吸速率变化
锈赤扁谷盗SH种群试虫注射特异性dsds和ds后，呼吸速率的变化如图7所示，目标线粒体编码基因被有效沉默后，与阴性对照组（ds）相比处理组试虫呼吸速率显著降低（＜0.05），分别降低17.67%（图7-A）、21.40%（图7-B）和22.33%（图7-C）。
2.8 RNA干扰后锈赤扁谷盗磷化氢敏感性变化
锈赤扁谷盗SH种群试虫注射特异性dsds和ds后，再经磷化氢（LC30=0.0122 mg·L-1）熏蒸20 h后死亡率的变化如图8所示，线粒体基因被有效沉默后，试虫的死亡率与对照组（ds）相比显著降低（＜0.05），即锈赤扁谷盗对磷化氢敏感性显著下降，死亡率分别降低33.33%（图8-A）、41.10%（图8-B）和47.78%（图8-C）。
图6 RNA干扰后锈赤扁谷盗线粒体编码基因表达水平变化
图7 RNA干扰后锈赤扁谷盗呼吸速率变化
图8 RNA干扰后锈赤扁谷盗磷化氢敏感性变化
3.1 不同磷化氢抗性种群锈赤扁谷盗的呼吸速率
线粒体是细胞内负责能量生产的重要器官，其能量转换效率直接影响细胞及整个生物体的能量代谢和功能状态，呼吸速率则是线粒体功能的重要指标，反映线粒体在氧化磷酸化过程中的能量转换效率[28-29]。研究发现，呼吸作用是昆虫吸收磷化氢的主要途径，昆虫对磷化氢敏感程度与其自身呼吸速率密切相关，即害虫增强呼吸速率可提升其药剂敏感性，而抑制昆虫呼吸速率则可增强其磷化氢耐受性，表明昆虫呼吸速率会伴随试虫磷化氢抗性水平变化而呈现动态变化[30-33]。类似地，本研究发现不同地理种群的锈赤扁谷盗呼吸速率与试虫磷化氢抗性水平呈负相关关系，即随着磷化氢抗性水平增加储粮害虫呼吸速率显著降低（图1）。
3.2 不同磷化氢抗性种群和磷化氢胁迫下锈赤扁谷盗线粒体编码基因表达变化
线粒体是磷化氢在昆虫体内的主要靶标位点，该熏蒸剂直接作用于线粒体的电子传递链，通过降低线粒体膜电位，显著提升虫体内活性氧（ROS）水平，从而引起氧化损伤，最终致使害虫死亡。线粒体编码基因直接参与形成线粒体电子传递链的多个组分，这些基因的转录和翻译水平影响线粒体复合体的量和质，从而调节整个电子传递链的活性[34-35]。SCHLIPALIUS等研究表明，昆虫线粒体编码基因的表达水平下降，会导致线粒体的功能改变，进而影响昆虫呼吸速率，导致害虫对磷化氢的敏感性显著降低[19-20]。与之相似，本研究发现锈赤扁谷盗13个线粒体编码基因在不同地理种群试虫中的表达水平与呼吸速率变化模式相一致，即基因在抗性种群试虫中表达水平被显著抑制（图2）。随后，选取线粒体复合体I中2个线粒体基因（和）和线粒体复合体V中的线粒体基因进行后续磷化氢胁迫和RNA干扰的功能研究。磷化氢胁迫试验显示，经熏蒸剂处理12 h，上述3个关键线粒体基因表达水平显著下降（图4），表明磷化氢胁迫条件下可引起关键线粒体基因的应激反应，即磷化氢可以抑制线粒体呼吸链上关键基因的表达，进而可能影响昆虫正常呼吸速率，从而降低磷化氢通过呼吸反应进入锈赤扁谷盗体内的量，暗示锈赤扁谷盗磷化氢抗性形成与线粒体编码基因间可能存在密切联系。同样，对三色书虱（）和玉米象的研究发现经辣根素熏蒸处理后，众多线粒体编码基因包括等的表达水平均被显著抑制[36-37]。
3.3 不同磷化氢抗性种群和磷化氢胁迫下锈赤扁谷盗线粒体复合体活性变化
线粒体复合体的活性是电子传递和质子泵动力的核心，这些复合体的活性高低直接影响到跨线粒体内膜的质子梯度建立及ATP合酶的ATP合成效率[38]。TAUBER等研究发现，线粒体编码基因的表达水平发生变化会相应地改变复合体蛋白的合成，进而影响到ETC的效能和呼吸速率[39]。例如，编码复合体I亚基的基因表达增强会增加复合体I的装配和活性，从而提高呼吸速率，而这种调控可能通过反馈机制影响其他线粒体复合体的活性[40-43]。本研究发现在不同磷化氢抗性种群试虫和磷化氢胁迫处理条件下，锈赤扁谷盗线粒体复合体I和V的活性变化与相应线粒体编码基因的表达模式相一致，即在抗性试虫和磷化氢胁迫下酶的活性均显著降低（图3、图5）。同样，针对玉米象的研究揭示了磷化氢熏蒸对玉米象线粒体复合体I和V活性的抑制效果[44]，且辣根素熏蒸处理显著降低玉米象线粒体复合体I和IV酶的活性[37,45]。此外，线粒体复合体活性的降低与磷化氢抗性增强相关[46]，如线粒体编码基因表达水平的下调导致秀丽隐杆线虫（）的磷化氢抗性增加，当线粒体复合体活性被抑制时，也会增强对磷化氢的抗性[33]。根据以上研究可以看出磷化氢等熏蒸剂对线粒体编码基因和复合体活性的影响是显著的，磷化氢熏蒸导致线粒体编码基因的表达水平显著下调，这可能会影响线粒体复合体的组装和活性，进一步暗示线粒体编码基因与磷化氢抗性间的密切关系。
3.4 沉默线粒体编码基因显著降低锈赤扁谷盗磷化氢敏感性
采用RNA干扰技术开展进一步的功能研究，线粒体编码基因和被有效沉默后，发现锈赤扁谷盗呼吸速率显著降低（图7），且试虫经磷化氢熏蒸处理后锈赤扁谷盗的死亡率显著降低，表明该害虫磷化氢敏感性显著降低（图8）。锈赤扁谷盗呼吸速率的降低可能归因于关键线粒体编码基因被沉默后，试虫电子传递链蛋白质的合成受到影响，进而降低线粒体复合体酶的活性水平。同时推测，昆虫呼吸速率降低会减少磷化氢的摄入量，从而降低磷化氢对电子传递链的影响，使得害虫能够更有效地承受磷化氢的毒性压力，增强锈赤扁谷盗对磷化氢适应性，最终导致昆虫对磷化氢敏感性显著降低。类似地，玉米象线粒体编码基因被有效沉默后，试虫对辣根素的敏感性显著下降[43]。有研究证实磷化氢可直接作用于线粒体，线粒体功能的直接改变可能与昆虫磷化氢抗性形成有关，并发现沉默线粒体呼吸链基因可导致高达10倍的磷化氢抗性增加[33]。此外，基于RNA干扰技术，沉默线虫中21个线粒体呼吸链基因，可导致线虫的呼吸速率降低，磷化氢敏感性显著降低，揭示了磷化氢抗性的产生可能与线粒体呼吸链的相关基因有关[47]。基于上述研究，可以推测线粒体编码基因表达水平的变化及线粒体复合体活性改变是储粮害虫适应磷化氢胁迫和抗性形成的重要机制之一。即锈赤扁谷盗线粒体编码基因表达量和复合体酶活性的降低，导致电子传递链的效率下降，从而降低试虫呼吸速率而减少磷化氢的吸收，最终增强害虫对磷化氢的耐受性。
锈赤扁谷盗的呼吸速率均随试虫磷化氢抗性倍数的增加而显著下降，表明具有较低呼吸速率的害虫群体对磷化氢展现出更高的耐受性。锈赤扁谷盗线粒体编码基因的表达水平以及线粒体复合体的活性均与其磷化氢抗性水平呈负相关关系；
且在磷化氢熏蒸处理条件下，锈赤扁谷盗关键线粒体编码基因和表达水平以及线粒体复合体活性均被显著抑制。通过RNA干扰技术有效沉默和，锈赤扁谷盗呼吸速率显著降低，且试虫对磷化氢敏感性显著降低。综上，推测锈赤扁谷盗可通过抑制线粒体编码基因表达，进而降低呼吸速率而增强害虫磷化氢抗性水平，表明线粒体编码基因与储粮害虫磷化氢抗性形成密切相关。
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Mitochondrial Protein-Coding Genes,andare Involved in Phosphine Resistance of
CHEH ErHu, YUAN GuoQing, CHEN Yan, CHEN MengQiu, SUN ShengYuan, TANG PeiAn
College of Food Science and Engineering/Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety of Jiangsu Province/Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing of Jiangsu Province, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023
【Background】is one of the most economically important stored-grain pests, and its phosphine resistance is particularly prominent. Mitochondria are important organelles in living organisms, which are the core site for insects to undergo respiratory metabolic reactions. Mitochondrial protein-coding genes (PCGs) are involved in regulating physiological processes of insects, such as respiratory rate, energy metabolism, and cell signal transduction.【Objective】The objective of this study is to clarify the roles of mitochondrial PCGs in phosphine resistance of.【Method】The respiratory rates of different phosphine resistant populations ofwere measured by using a CO2detector. The Taicang and Shanghai populations ofwith greatest differences in phosphine resistance levels and respiratory rates were selected to analyze the expression patterns of mitochondrial PCGs by using RT-qPCR technology, and the activities of mitochondrial complexes I and V were measured as well. The expression levels of three key mitochondrial PCGs including,and, and the activities of mitochondrial complex I and V were determined after phosphine fumigation treatments in. RNA interference (RNAi) was used to silence,and, and then the changes of respiratory rate and phosphine sensitivity ofwere analyzed.【Result】There was a negative correlation between the respiratory rate and phosphine resistance levels of,that is, the respiratory rates significantly decreased with the increase of phosphine resistance levels. The RT-qPCR results showed that the expression levels of mitochondrial PCGs in the highly phosphine resistant population (Taicang population, RR=1 906.8) ofwere significantly lower than those in the relatively sensitive population (Shanghai population, RR=1.4), and the enzyme activities of mitochondrial complexes I and V were consistent with the expression patterns of mitochondrial PCGs. The expression levels of three key mitochondrial PCGs,,and, and the activities of mitochondrial complexes I and V were significantly inhibited after phosphine fumigation treatments in. The key mitochondrial PCGs,,andwere silenced by injecting dsRNA, which resulted in a significant decrease in respiratory rate and phosphine sensitivity of.【Conclusion】The mitochondrial PCGs are involved in phosphine resistance of.
; stored-grain pest; phosphine resistance; mitochondria; RNA interference (RNAi)
10.3864/j.issn.0578-1752.2024.09.008
2023-12-13；
2024-01-16
国家重点研发计划（2023YFD1701203，2021YFD2100604）、江苏省重点研发计划（BE2022377）、国家自然科学基金（32001915，32272388）、江苏高校优势学科建设工程资助项目（YXK2103）
陈二虎，E-mail：erhuchen1104@163.com。通信作者唐培安，E-mail：tangpeian@163.com
（责任编辑 岳梅）
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