戴华鑫 梁太波 李彩斌 罗贞宝 关罗浩 钟帅 翟振 边文杰 黄卫 张艳玲
摘要：【目的】明確烟秆生物炭对植烟黄棕壤养分、细菌群落结构与功能的影响，为提高烟秆的资源化利用提供理论依据。【方法】基于大田试验，比较不同用量烟秆生物炭（0、5、15、20和40 t/ha）施用4年后烟田土壤养分指标及细菌丰度变化；
采用16S rDNA序列高通量测序技术和PICRUSt基因预测方法，分析耕层土壤细菌群落结构、多样性及代谢功能变化。【结果】随着生物炭施用量的增加，土壤pH、有机质、总氮、有效磷、速效钾含量及细菌丰度呈增加趋势。主坐标分析（PCoA）和聚类分析结果表明，施用生物炭改变了细菌群落组成。生物炭用量在15 t/ha时，土壤细菌OTU丰富度及Alpha多样性指数最高；
在门水平上，变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）相对丰度较低，而芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、浮霉菌门（Planctomycetes）和硝化螺旋菌门（Nitrospirae）相对丰度较高；
在属水平上，芽单胞菌属（Gemmatimonas）、黄色土源菌属（Flavisolibacter）和Roseiflexus相对丰度较高。冗余分析（RDA）结果表明，生物炭用量与土壤拟杆菌门显著正相关（P<0.05，下同），与酸杆菌门显著负相关。PICRUSt功能预测表明，施用生物炭增加了与土壤碳代谢相关的细菌基因丰度。【结论】贵州植烟黄棕壤施用烟秆生物炭后，土壤养分、烤烟农艺性状和经济性状指标均有提升，土壤细菌群落丰富度及多样性显著提高，土壤细菌碳代谢能力增强，对改善烟田土壤微生态具有积极作用。以15 t/ha烟秆生物炭作用效果较好，可在生产上推广应用。
关键词：生物炭；
植烟黄棕壤；
土壤养分；
细菌群落；
功能预测
中图分类号：S572.01 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2023）02-0476-12
Abstract：【Objective】In order to explore the effects of tobacco-stalk biochar （BC） on soil nutrients the structure and functioning of bacterial communities in tobacco-planting yellow-brown fields，and provide theoretical basis for the utilization of tobacco stalk. 【Method】A field experiment with different biochar dosages（0，5，15，20，40 t/ha） was set up to compare the changes of soil nutrient indexes and bacterial abundance of tobacco field after four years application. The 16S rDNA high-throughput sequencing and PICRUSt gene prediction analysis were used to decipher soil community composition， diversity and metabolic function. 【Result】The results showed that soil pH，organic matter，total nitrogen，available phosphorus，available potassium and the abundance of soil bacteria significantly increased with the dosage of biochar application. The results of principal coordinate analysis （PCoA） and cluster analysis show that soil bacterial community composition was significantly altered by the biochar application. When the amount of tobacco-stalk biochar was 15 t/ha，bacteria OTU richness and Alpha diversity indexes were higher than other treatments. At the phylum level，the relative abundance of Proteobacteria and Actinobacteria was lower under 15 t/ha than other treatments，but those of Gemmatimona-detes，Chloroflexi，Planctomycetes and Nitrospirae were high. At the genus level，the relative abundance of Gemmatimonas，Flavisolibacter，Roseiflexus was higher under 15 t/ha than other treatments. Redundancy analysis（RDA） analysis showed that biochar application dosage was significantly positively correlated with the relative abundance of Bacteroidetes（P<0.05， the same below），while negatively correlated with Acidobacteria. PICRUSt functional prediction analysis suggested that biochar application increased the functional gene abundance related to soil carbon metabolism in bacterial community. 【Conclusion】After applying tobacco-stalk biochar to the yellow-brown tobacco-planting soil in Guizhou， soil nu-trients， agronomic and economic indicators of flue-cured tobacco are improved， and the richness and diversity of soil bacterial communities are significantly increased. The carbon metabolism ability of soil bacteria is enhanced， which has a positive effect on improving the soil microecology of tobacco fields. In sum， the effect of using 15 t/ha tobacco-stalk biochar isrelatively better and can be popularized in tobacco production.
Key words：
biochar；
tobacco-planting yellow-brown soil；
soil nutrients；
bacterial community；
function prediction
Foundation items：
Key Scientific and Technological Project of China National Tobacco Corporation （110201902004）；
Science and Technology Project of China Tobacco Guangdong Industrial Co.， Ltd.（QJ/GY G03.009/02）；
Youth Talent Support Project of Zhengzhou Tobacco Research Institute（112020CR0250）
0 引言
【研究意义】生物炭是农业废弃有机物等经高温低氧或限氧环境热解后产生的一种富碳物质（Blanco-Canqui，2017）。生物炭具有丰度的微孔结构、较大的比表面积、较高的稳定性和吸附能力，在改良土壤、固碳减排、修复环境等方面具有很大的应用前景（Oni et al.，2019）。烟草是我国主要的经济作物之一，我国烟区每年生产近450万t烟草秸秆（李文豪，2019），主要处理方式是直接燃烧和秸秆还田。秸秆燃烧在造成环境污染的同时也浪费了生物质资源，直接还田则可能引起病虫害爆发进而造成烟草产质量下滑。有研究报道，合理施用生物炭可提高土壤保水性能（Wang et al.，2020；
曾凤玲等，2022），增加土壤碳氮储量和有效养分含量（黄雁飞等，2020；
张珂珂等，2022），修复土壤重金属污染（白珊等，2021），改良作物根系发育状况（陈懿等，2017），有利于作物生长和品质提升（李青山等，2021；
李松伟等，2021；
王志丹等，2022）。贵州是我国第二大烟叶产区，黄棕壤是当地烤烟种植的主要土壤类型之一。因此，研究烟秆生物炭还田对植烟黄棕壤养分、细菌群落结构与功能的影响，对改善当地植烟土壤性质、烟秆的合理利用及生态保护均具有重要意义。【前人研究进展】土壤微生物是土壤碳氮循环的“推进器”和土壤养分有效性的“转换器”，由于土壤微生物对环境变化的敏感性，其自身种群多样性及优势菌属的变化可在一定程度上指示土壤肥力和质量状况的高低（Luo et al.，2016；
桂意云等，2022）。王光飞等（2017）通过盆栽试验研究秸秆生物炭（0～2%）对种植辣椒土壤性状的影响，结果发现土壤pH、有机质、有效磷和速效钾含量随着生物炭用量的增加逐渐上升，土壤细菌及4种功能菌数量也逐步增加，微生物代谢能力、多样性及均匀度均与生物炭用量呈倒U型曲线关系，其在1.33%用量时达最高值。况帅等（2021）在田间植烟红壤中添加油菜秸秆生物炭（0～9 t/ha），发现土壤养分、细菌OTU数目、菌群丰度和多样性等明显增加，土壤中主要优势菌群变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）与酸杆菌门（Acidobacteria）与土壤有效磷和速效钾含量呈显著正相关。姚丽茹等（2022）在半干旱农业地区通过长期田间定位试验研究施用小麦秸秆生物炭（0～20 t/ha）后作物生长及土壤细菌群落的变化，结果显示随着生物炭施用量的增加，土壤pH、有机碳、全氮、小麦生物量和产量呈上升趋势，变形菌门（Proteobacteria）和浮霉菌门（Planctomycetes）相对丰度增加，土壤细菌群落变化主要受生物炭施用量和采样时期的影响，以10～20 t/ha生物炭用量较合适。然而，Zhang等（2021）在东北黑土单次施用10～50 t/ha玉米秸秆生物炭3年后，发现土壤细菌香农指数显著降低。由此看出，生物炭对土壤细菌群落结构的影响并不一致，这可能与土壤类型、利用方式及生物炭种类、用量等因素有关。在烤烟生产中，叶协锋等（2015）研究指出，适量添加生物炭可改善烤后烟叶单料烟评吸质量，以常规施肥配施600 kg/ha生物炭用量的处理效果最好，而过量的生物炭可能会对烤后烟叶品质造成负面影响；
邓建强等（2018）研究指出，适量生物炭可降低土壤可能致病菌属的相对丰度，但高剂量施用将增大烟叶生产感病风险。【本研究切入点】前人关于生物炭的研究多集中于施用当年单一阶段的变化，而关于生物炭施用多年后土壤养分和细菌群落变化的研究相对较少，尤其是针对贵州植烟黄棕壤施用生物炭后土壤养分和细菌群落变化的研究尚无报道。【拟解决的关键问题】通过大田试验，重点研究烟秆生物炭施用4年后对植烟土壤养分、细菌群落结构及功能的影响，旨在阐明生物炭对贵州典型植烟黄棕壤微生态的调控效应，为提高烤烟秸秆的资源化利用提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
生物炭（烟秆）材料来自贵州金叶丰农业科技有限公司。烟秆在380 ℃下裂解2 h制备成烟秆生物炭，其基本性质为：pH 9.18、碳48.3%、氢3.93%、氧31.4%、氮1.50%、全磷2.38%、全钾2.44%、速效钾161.9 mg/kg、比表面积1.47 m2/g、总孔隙体积0.0075 cm3/g、平均孔直径20.31 nm。供试烟草品种为云烟87。土壤类型为黄棕壤，2018年3月下旬拔除前茬烟秆和杂草后采集基础土样，检测土壤理化指标：pH 5.40、有机质21.0 g/kg、总氮0.96 g/kg、全磷1.00 g/kg、全钾1.71%、碱解氮102.90 mg/kg、有效磷28.30 mg/kg、速效钾196.40 mg/kg。
1. 2 试验方法
试验于2018—2021年在贵州威宁黑石镇科技园（东经103°59′55″、北纬26°45′14″）进行。2018年5月，将烟秆生物炭一次性施入大田，考虑生物炭实际成本及田间承载状况，用量分别为0 t/ha（CK）、5 t/ha（T1）、15 t/ha（T2）、20 t/ha（T3）和40 t/ha（T4），之后不再施入生物炭；
生物炭在起垄前均匀撒施在土壤中，随后将其与耕层土壤迅速旋耕混匀。施肥用量参照当地常规优质烤烟生产，每公顷施用酒糟有机肥1800.0 kg、复合肥（9-13-22）525.0 kg、提苗肥（15-8-7）37.5 kg和追肥（13-0-26）300.0 kg。随机区组设计，3次重复，共15个小区，株距0.55 m，行距1.10 m，小区面积74.8 m2（长11.0 m、寬6.8 m），试验地面积1122.0 m2。基肥在移栽前结合有机肥窝施，提苗肥于移栽时结合定根水施用（肥料融入水中浇灌）、移栽25 d后穴施追肥，其他各项田间生产管理措施统一按当地技术规范进行。
连续4年种植烤烟，2021年8月在圆顶期测量烟株农艺性状，9月大田烟叶采收结束后，在每小区选取8株烟株，采集每2株烟株中心点处的耕层（0～20 cm）土壤，均匀混合成1个样品。每个样品分成2份，1份放入冰盒运回实验室，用于土壤细菌丰度及多样性检测；
另1份装于布袋中，带回实验室自然风干，过筛后用于土壤养分指标测定。采收烟叶统一装于烤房中部，按当地常规烘烤工艺烘烤和分级收购，统计烟叶经济性状。
1. 3 测定指标及方法
1. 3. 1 土壤养分指标测定 参照《土壤农业化学分析方法》（鲁如坤，2000）测定土壤养分指标。土壤pH采用水浸提电位法（水土比2.5∶1）测定；
土壤有机质含量采用重铬酸钾外加热法测定；
土壤总氮和碱解氮含量分别采用半微量凯氏定氮法和碱解扩散法测定；
土壤有效磷及速效钾含量分别采用用氟化铵—盐酸浸提—钼锑抗比色法及醋酸铵浸提—火焰光度法测定。
1. 3. 2 土壤细菌DNA提取与扩增 采用土壤DNA提取试剂盒（PowerSoil DNA Isolation Kit，MOBIO，USA）对土壤样本提取基因组DNA，提取后的DNA利用琼脂糖凝胶电泳进行检验，检验合格后，将DNA样本放入-20 ℃条件保存，后续用于qPCR检测及二代高通量测序。qPCR检测和二代高通量测序中均采用16S rRNA基因V4～V5区域通用引物，引物序列为515F（5"-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3"）和926R（5"-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3"），由微基生物科技（上海）有限公司完成测序及分析。
1. 3. 3 土壤细菌丰度的qPCR检测 运用染料法荧光定量PCR检测土壤样本中细菌16S rRNA基因V4～V5区的拷贝数。采用16S rRNA基因V4～V5区通用引物扩增基因组DNA，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒（Axygen，USA）回收PCR产物，随后进行TA克隆，筛选阳性克隆进行测序，并采用质粒提取试剂盒（Axygen，USA）进行质粒提取。采用Qubit 3.0（Invitrogen，USA）测定质粒DNA浓度，根据质粒浓度和质粒DNA相对分子量计算标准质粒拷贝数。将构建好的标准质粒进行10倍梯度稀释，作为模板，构建标准曲线。qPCR反应总体系20.0 μL：2×SYBR Premix Ex TaqTM10.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，ROX 0.4 μL，DNA模板3.0 μL，ddH2O补足至20.0 μL。每个反应3个平行，阴性对照采用ddH2O作为模板。PCR扩增程序：95 ℃预变性30 s；
95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行40次循环。荧光数据采集在延伸时进行。实时定量PCR在ABI 7900HT型荧光定量PCR仪中进行。结果以每克样本中16S V4～V5区基因拷贝数统计。
1. 3. 4 土壤细菌多样性的二代高通量测序 采用二代高通量测序技术检测土壤样本中细菌多样性。采用两步PCR扩增方法构建文库（戴华鑫等，2017），第一步采用含有部分测序引物和16S rRNA基因V4～V5通用引物的融合引物进行PCR扩增目的片段；
以回收的PCR产物为模板，进行第二步扩增，添加Barcode和测序接头序列，并用FTC-3000TM Real-Time PCR仪进行荧光定量，均一化混匀后完成文库构建，文库质控合格后，采用Illumina NovaSeq 6000进行测序。
1. 3. 5 PICRUSt2功能预测 基于OTU的代表序列和丰度信息，采用PICRUSt2进行功能和代谢途径预测分析，通过比对KEGG数据库获得不同代谢通路的丰度信息（Langille et al.，2013）。
1. 4 数据分析
二代高通量原始测序结果经Trimmomatic初步质控后，采用Flash进行序列拼接，采用UPARSE按照序列97%相似性进行OTU（Operational taxonomic unit）聚类，同时去掉singletons序列，每个OTU得到1条代表序列，采用mothur的classify.seqs命令与SILVA 128数据库比对，进行物种信息注释，阈值设置0.6。根据注释结果，分别在门、属分类水平上统计微生物相对丰度，并采用R语言ggplot2进行可视化（Gao et al.，2020）。利用R语言vegan包中的estimateR函数计算Chao和ACE丰富度指数，diversity函数计算Shannon多样性指数，picante包的pd函数计算PD_whole_tree，rda函数进行冗余分析（RDA），采用ggplot2程序包对结果进行可视化。Beta多样性分析，采用R语言ape程序包進行weighted.unifrac分析，dendextend包进行聚类树分析，基于OTU数据，采用bray curtis算法进行主坐标分析（PCoA），聚类树形图和PCoA图采用ggplot2进行可视化。采用vegan包中的adonis函数，对bray curtis结果进行adonis分析。ggpubr包进行Kruskal-Wallis秩和检验，对样本间属水平微生物丰度进行差异分析（Wang et al.，2019）。采用SPSS 24.0的单因素方差分析和Duncans新复极差法进行差异显著性检验（P<0.05）。
2 结果与分析
2. 1 不同生物炭用量对土壤养分的影响
由表1可知，随着生物炭用量增加，土壤pH、有机质、总氮、有效磷和速效钾含量均呈增加趋势，碱解氮含量无显著变化（P>0.05，下同）。T4处理的土壤有机质、速效钾含量分别为49.53 g/kg、691.00 mg/kg，显著高于其他处理（P<0.05，下同）；
土壤pH、总氮、有效磷含量高于CK和T1处理。由此可见，施用烟秆生物炭对土壤养分具有明显的提升作用。
2. 2 不同生物炭用量对烤烟农艺性状和经济性状的影响
由表2可知，施用生物炭后烤烟的茎围、上部叶最大叶长、中部叶最大叶长显著高于CK，株高、上部叶最大叶宽、中部叶最大叶宽、叶数等农艺性状与在各处理间均无显著差异。从烤烟经济性状来看，T1、T2处理的烟叶产量和产值显著高于其他处理，不同处理间烤烟均价、上等烟和中等烟比例无显著差异（表3）。
2. 3 不同生物炭用量对土壤细菌丰度的影响
由图1可看出，土壤细菌丰度随着生物炭用量的增加呈增加趋势。与CK相比，增施5、15、20 t/ha生物炭后，T1、T2和T3处理的土壤细菌丰度增加不显著；
生物炭施用量增加至40 t/ha时，T4处理的土壤细菌丰度为1.82×108 CFU/g，显著高于其他处理。
2. 4 不同生物炭用量对土壤细菌Alpha多样性的影响
由表4可知，样品序列覆盖率均达0.99以上，说明文库中包含细菌群落的绝大多数细菌类群，基本能反映群落结构组成。与其他处理相比，CK的土壤细菌OTUs和Alpha多样性指数處于较低水平；
随着生物炭用量的增加，细菌OTUs和Alpha多样性指数（Chao、ACE、Shannon、PD_whole_tree）均呈先升高后降低的变化趋势，T2处理的土壤细菌群落Alpha多样性指数均为最高。
2. 5 不同生物炭用量对土壤细菌群落结构的影响
由图2可看出，土壤优势细菌相对丰度高于1.00%的细菌门有变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、浮霉菌门（Planctomycetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和硝化螺旋菌门（Nitrospirae）。疣微菌门（Verrucomicrobia）和装甲菌门（Armatimo-nadetes）的相对丰度在0.50%～1.00%，其他细菌门的相对丰度均低于0.50%。与其他处理相比，生物炭用量为15 t/ha时（T2处理）土壤变形菌门、放线菌门相对丰度较低，分别为25.70%和22.58%；
芽单胞菌门、绿弯菌门、浮霉菌门、硝化螺旋菌门相对丰度较高，分别为12.35%、8.13%、3.34%、1.69%和0.63%。随着生物炭用量的增加（CK～T4处理），酸杆菌门相对丰度呈明显降低趋势，分别为17.70%、14.39%、13.10%、12.54%和10.48%，拟杆菌门相对丰度呈明显增加趋势，分别为3.46%、5.14%、7.79%、8.39%和11.06%。
由图3可看出，生物炭用量对不同细菌属相对丰度的影响存在差异。随着生物炭用量的增加，多数细菌群落属水平相对丰度总体呈下降趋势。与其他处理相比，T4处理的Gemmatirosa、Bryobacter、水恒杆菌属（Mizugakiibacter）、Gaiella、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、念珠菌固体杆菌属（Candidatus_Solibacter）、Reyranella、Jatrophihabitans、Dyella、马杜拉放线菌属（Actinomadura）、放线异壁酸菌属（Actinoallomurus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）等细菌丰度较低；
T2处理的芽单胞菌属（Gemmatimonas）、黄色土源菌（Flavisolibacter）、Roseiflexus等细菌丰度相对较高；
T3处理的放线菌属（Actinophytocola）、Reyranella、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）等细菌丰度相对较高，即总体呈先升高后降低的抛物线趋势；
Acidibacter的相对丰度则呈先降低后升高的变化趋势。
基于OTU层次的非加权组平均法聚类分析结果表明，包括CK在内的不同样品可分为三大类；
CK与T1处理距离相对较近，T2处理与T3处理距离相对较近，T4处理距离其他处理相对较远（图4）。该结果与试验处理设置相一致，同时表明，与CK相比，生物炭施用4年后仍然改变着烟田耕层土壤的细菌群落结构。
基于OTU水平和Bray-curtis距离的PCoA分析结果（图5）表明，不同生物炭用量处理的土壤细菌群落组成出现明显区分，前两轴共解释75.03%的群落变异，adonis结果也说明不同处理间存在极显著差异（P<0.001）。CK样品沿第1轴与T2、T3和T4处理的3组样品明显分开，T2、T3和T4处理样品沿第2轴分开。
2. 6 土壤细菌与环境因子的相关性
细菌群落门水平与土壤环境因子的RDA分析结果（图6）显示，第1轴的解释变异量为80.22%，第2轴的解释变异量为14.68%，两轴共解释总变异的94.90%。在环境因子方面，生物炭与pH、有效磷、有机质、总氮、速效钾呈锐角，呈正相关关系，与土壤碱解氮呈钝角，呈负相关关系。细菌群落与土壤理化性质方面，拟杆菌门（Bacteroidetes）与土壤有机质、pH、生物炭、总氮、速效钾呈正相关关系，与碱解氮呈负相关关系；
酸杆菌门（Acidobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）均与土壤总氮、速效钾、有效磷、pH、生物炭呈负相关关系，与碱解氮呈正相关关系；
绿弯菌门（Chloroflexi）与土壤碱解氮呈负相关关系；
变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）受生物炭影响相对较小。因此，生物炭用量与土壤拟杆菌门呈正相关关系，与酸杆菌门呈负相关关系。
2. 7 土壤细菌群落PICRUSt功能预测分析
将预测得到的功能基因家族（图7）与KEGG数据库比对发现，对于第一等级，所有菌群的基因序列注释到的预测功能可分为6类，其中前4类分别是：新陈代谢（Metabolism）、环境信息加工（Environmental Information Processing）、遗传信息加工（Genetic Information Processing）和细胞过程（Cellular Processes）。对于第二等级，参与新陈代谢的菌群中，以参与碳水化合物代谢（Carbohydrate metabolism）、氨基酸代谢（Amino acid metabolism）、能量代谢（Energy meta-bolism）、辅助因子及维他命代谢（Metabolism of cofactors and vitamins）的为最大类群；
参与遗传信息加工的菌群中，参与遗传信息翻译（Translation）、复制和修复机制（Replication and repair）的类群具有明显优势；
参与环境信息加工的菌群中，参与膜运转类群（Membrane transport）具有明显优势，其次是参与信号转导（Signal transduction）的类群；
参与细胞过程的菌群中，以参与原核生物细胞群落代谢（Cellular community-prokaryotes）的为最大类群。
2. 8 代谢相关基因分析
图8为所测土壤样品KEGG直系同源基因簇（KO）丰度热图，横坐标为不同生物炭用量处理，纵坐标表示代谢相关基因编码酶的丰度。分析发现，氨基酸代谢、碳水化合物代谢和能量代谢通路上的相关基因表达差异较明显；
可大致聚为CK和生物炭两类，不同生物炭用量间也存在差异，其中T4与其他3个生物炭处理差异相对较大。以细菌群落多样性指数较高的T2处理与CK相比，土壤代谢相关基因丰度升高的占比较大，包括与能源物质代谢密切相关的转酮醇酶（K00615），与碳代谢相关的脱氢酶（K00058、K00382、K01754、K01687），与脂肪酸合成代谢相关的酰基载体蛋白（K02078）、3-氧酰基［酰基载体蛋白］合酶（K00648、K09458）及酰基转移酶（K00655），作用于组氨酸的氨基转移酶（K00817）及支链氨基酸的氨基转移酶（K00826），与色氨酸代谢相关酶（K00128），参与核酸错配修复的酶（K03657），参与氨基酸合成相关酶（K01733）及ABC转运蛋白相关酶（K02066、K02067）。
3 讨论
通常认为，生物炭本身呈碱性，其高pH主要源于组分中的灰分包含大量K、Ca、Na等金属矿物，可有效降低土壤交换性H+含量，因此对于增加酸性土壤pH具有明显作用（Van Zwieten et al.，2010）。研究表明，施用生物炭后土壤总氮、有机质、有效磷和速效钾含量显著上升，且随着生物炭用量的增加效果较明显（张广雨等，2020）；
烟秆生物炭施用于田间后可提高烤烟根际土壤pH及有机碳含量（Jones et al.，2012）。本研究同样发现，随着生物炭用量逐渐增加，土壤pH、有机质、总氮、有效磷、速效钾含量呈增加趋势，可能与生物炭和肥料的互补或协同作用有关。生物炭巨大的内表面积、较高的孔隙结构、丰富的官能团能吸附多种离子，延缓土壤中肥料养分的释放，提高土壤保肥性能和碳氮比（李彩斌等，2018），调节土壤肥力平衡，改变土壤微生物定殖栖息地环境（张璐等，2019）。此外，土壤pH是影响微生物生长代谢的主要因子之一；
当pH从酸性向中性范围变化时，土壤微生物量会随着pH的升高而增加（Aciego et al.，2008）。本研究中，施入生物炭后土壤细菌丰度显著增加，可能与生物炭的多孔结构、土壤pH增加及微生态环境的改善等多重因素叠加有关（Oni et al.，2019）。生物炭中部分易分解炭可作为微生物生长的基质，施用生物炭可刺激土壤微生物的繁殖和活力，并发生起爆效应（Chen et al.，2017）；
适量生物炭可提高土壤细菌群落的丰度和多样性，但超过一定用量后细菌OTUs数量则会下降，致病菌丰度增加（邓建强等，2018），其原因可能与高用量生物炭对土壤性状产生的负面影响有关（王光飞等，2017）。本研究发现，施用生物炭处理的土壤细菌群落Alpha多样性指数相对较高，尤其以15 t/ha处理的土壤细菌群落较丰富。因此，对于贵州烟区黄棕壤土壤细菌群落组成来说，结合烟秆生物炭自身特性、土壤类型及试验地条件等多种因素，施用该用量的烟秆生物炭较理想。
酸杆菌门是土壤生态系统中一个较丰富、难以培养的细菌群落，在关键碳、氮和硫等生物地质化学循环中扮演重要生态角色（Kalam et al.，2020）。大多数酸杆菌更喜欢在酸性条件下生长，较低的pH条件下酸杆菌丰度通常较高（Lladó et al.，2018）。本研究中，由于生物炭施用提高了土壤pH，可能是酸杆菌丰度随着生物用量增加而降低的原因之一。研究表明，在土壤微生物区系中，拟杆菌门能分泌多种碳水化合物活性酶，降解来源于动植物残体的多聚糖及纤维素（Larsbrink and McKee，2020）。施用生物炭可显著提高土壤放线菌门和拟杆菌门的多样性和生物量，改善土壤微生物群落结构（Liu et al.，2020）。在生物炭改良土壤的根际相关群落中，拟杆菌门的相对丰度较高（Kolton et al.，2011）。Liao等（2019）利用13CO2标记，发现在豆科间作系统中，施用生物炭不仅改变了根际细菌群落结构和多样性，还提高了拟杆菌成员（芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌等）的相对丰度。本研究发现，生物炭用量与土壤拟杆菌门显著正相关，在15或20 t/ha用量时，土壤放线菌属、芽单胞菌属、类芽孢杆菌属相对丰度明显增加。放线菌是产生抗生素的主要细菌之一，土壤中放线菌数量及其比例对土壤微生物生态平衡调整有重要作用（张璐等，2019）；
芽孢杆菌属、假单胞菌属为植物根际促生菌，其主要功能是分泌植物生长调节剂而促进植物生长（戴华鑫等，2020）。因此，从细菌群落多样性指数及细菌属功能来看，生物炭施用量在15或20 t/ha时效果较好。
農田土壤中存在大量具有特定生态功能的活跃微生物，这些微生物与新陈代谢活动紧密相关（LeBrun and Kang，2018）；
短期生物炭添加后即可改变土壤细菌群落组成（Wong et al.，2019），其对土壤碳库的固持能力可维持3年以上（Wang et al.，2021）。转酮醇酶是磷酸戊糖途径非氧化分支中的关键限速酶，对于能量转导和产生用于核酸合成的核糖至关重要，在微生物碳代谢中扮演重要角色（Wilkinson and Dalby，2019）；
酰基载体蛋白是脂肪酸合成中的关键蛋白质，3-氧酰基［酰基载体蛋白］合酶是一种长链脂肪酸合成酶，烯酰CoA水合酶是脂肪酸合成和分解代谢的关键分子（Khurana et al.，2010）。本研究中，上述与脂肪酸合成、能源物质及碳代谢有关酶编码基因丰度高于对照，说明生物炭施入土壤4年后土壤细菌碳源利用能力仍处于较高水平。支链氨基酸是一类具有多种生理和代谢作用的必需氨基酸（吕娜娜等，2018）。研究表明，氨基酸能促进土壤微生物活动，加快有机物矿化和土壤养分稀释，增加土壤微生物数量（张贵云等，2019）；
生物炭处理显著提升了与能量生产和转换、氨基酸转运代谢、核苷酸及碳水化合物转运代谢等相关功能的基因表达量（Gao et al.，2021）。ABC转运基因的功能不仅局限于转运，还包括通道调控和分子量变换等（Gong and Wang，2022），且与根系分泌物的释放量有关（Cox et al.，2019）。本研究发现，细菌丰度随着生物炭施入量增加而增加，且生物炭处理后的土壤养分相对较高，土壤细菌类群功能代谢及相关酶基因丰度改变可能是其原因之一。
4 結论
贵州植烟黄棕壤施用烟秆生物炭后，土壤养分、烤烟农艺性状和经济性状指标均有提升，土壤细菌群落丰富度及多样性显著提高，土壤细菌碳代谢能力增强，对改善烟田土壤微生态环境具有积极作用。其中以15 t/ha烟秆生物炭作用效果较好，可在生产上应用推广。
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（責任编辑 王 晖）
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